1、宮頸癌是導(dǎo)致全世界女性死亡的第二位惡性腫瘤，流行病學(xué)研究表明持續(xù)感染高危型HPV(human papillomaviruses)16/18是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因。高危型HPV主要依賴病毒基因組編碼的兩個病毒癌基因E6/E7來誘導(dǎo)感染細胞惡性轉(zhuǎn)化，而高危型HPVE7又是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要癌蛋白。E7蛋白的致癌活性主要是依賴與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb）的結(jié)合，使其泛素化降解，從而釋放具有活性的E2F，激活E2F的靶基因表達，從而促進

2、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。然而，在宮頸癌中E7/E2F下游與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的精確信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。因此該論文旨在探索HPVE7/E2F的下游靶通路，為宮頸癌的診斷與治療提供分子基礎(chǔ)。
　　通過分析四個公開報道的宮頸癌相關(guān)基因表達芯片數(shù)據(jù)，選取在四個數(shù)據(jù)庫中均表達上調(diào)2倍以上的基因。然后運用TFSEARCH（ver.1.3）軟件預(yù)測上述哪些基因的啟動子序列上含有E2F的結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)核糖核苷酸還原酶亞基M2基因RRM2在四個數(shù)據(jù)庫中

3、均表達上調(diào)2倍以上，RRM2的啟動子區(qū)域包含兩個E2F可能的結(jié)合位點。這些提示RRM2可能是HPVE7調(diào)控的靶基因。
　　RRM2蛋白是核苷酸還原酶的重要組成成分，是DNA合成過程中的限速酶。核苷酸還原酶的活性與癌細胞的分裂分化密切相關(guān)。許多研究表明RRM2與腫瘤的惡性生物學(xué)行為緊密相關(guān)，如過表達RRM2與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)。RRM2能夠激活一系列原癌基因促進腫瘤的生長，包括NF-κB、c-myc、v-fes和鳥氨

4、酸脫羧酶等，但是RRM2調(diào)控這些原癌基因的機制尚不清楚。RRM2過表達可以促進活性氧自由基的產(chǎn)生，活性氧能夠激活腫瘤生長過程中所需的MAPK、NF-κB和AP1的活性，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著重要作用。然而，目前還不清楚ROS是否參與到RRM2所介導(dǎo)的惡性腫瘤發(fā)生過程。
　　本研究通過生物信息學(xué)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在RRM2啟動子區(qū)有兩個保守的E2F結(jié)合位點，熒光素酶活性試驗證明了RRM2是HPVE7下游的靶基因。HPVE7是通

5、過結(jié)合Rb蛋白，使釋放的E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到RRM2的啟動子區(qū)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。對宮頸癌組織的免疫組化分析表明RRM2的蛋白表達水平和E7的表達呈正相關(guān)。這些結(jié)果證明了RRM2可能是HPVE7的下游靶基因。
　　其次本研究首次闡明了HPVE7通過RRM2調(diào)控HIF-1α和VEGF表達的分子機制。有研究報道，HPVE7能上調(diào)HIF-1α和VEGF的表達，而具體分子機制不明。另有研究報道，RRM2可以通過上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤細胞

6、的血管生成，但其具體的調(diào)控機制尚不清楚。于是假設(shè)RRM2作為HPVE7下游的靶基因，可能是通過促進VEGF的表達來影響宮頸癌的血管生成，從而在宮頸癌的發(fā)展中發(fā)揮作用。本文研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞系中過表達RRM2，可以促進活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成，ROS能夠激活ERK1/2信號通路使HIF-1α和VEGF的表達增加。當加入活性氧清除劑NAC后，由過表達RRM2所引起的ERK1/2信號通路激活以及

7、HIF-1α和VEGF的表達上調(diào)被抑制。另外體外血管形成實驗表明，由E7調(diào)控的RRM2過表達能夠促進HUVECs的血管形成，并且RRM2促進血管的形成是VEGF依賴的。在異種移植小鼠模型中，過表達RRM2的C33A細胞注射小鼠后，促進了腫瘤的生長，同時也增加了血管的形成密度。所以，本項目研究證實RRM2是受HPVE7調(diào)控的下游靶基因，HPVE7通過上調(diào)RRM2，產(chǎn)生ROS激活ERK1/2信號通路，促進HIF-1α和VEGF的表達，進而促