1、目的:研究可溶性CD40配體(solubleCD40ligand，sCD40L)對宮頸癌患者DC分化、成熟及其免疫活性的影響，并探討其作用機制，為sCD40L應(yīng)用于臨床宮頸癌綜合治療提供科學依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.采用密度梯度離心法分離出宮頸癌患者單個核細胞(MNC)，用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2h后，去除非貼壁細胞，收集貼壁的細胞。將得到的貼壁細胞加入細胞因子GM-CSF（20ng/ml）和

2、IL-4(20ng/ml)進行DC的誘導培養(yǎng)，隔日半量換液并補加細胞因子，培養(yǎng)5d后，將細胞分為三組:對照組只加入GM-CSF和IL-4;TNF-α組加入TNF-α(10ng/ml)、GM-CSF和口IL-4;sCD40L組加GM-CSF、IL-4及sCD40L（20ng/ml）。各組均培養(yǎng)至8d后收集細胞進行后續(xù)實驗。
　　 2.采用FCM檢測各組DC表面CD80、CD86、CD83、CD1a、MHC(I)及MHC(II)的表

3、達百分率。
　　 3.采用RT-PCR技術(shù)半定量檢測各組DC表達IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1mRNA的水平。并用ELISA技術(shù)檢測各組培養(yǎng)體系中IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1的含量。
　　 4.采用Westernblot和RT-PCR技術(shù)分別從蛋白和基因水平檢測sCD40L對樹突狀細胞信號通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3表達水平的影響。
　　 5.采用M

4、TT法通過混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測不同組DC刺激異基因T細胞增殖能力。
　　 6.采用ELISA技術(shù)分別檢測各組MLR體系中IFN-γ和IL-4的含量。
　　 7.采用MTT法檢測各組DC誘導負載凍融抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對Hela細胞株的殺傷活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.在誘導宮頸癌患者MNC分化為DC的過程中，不同組的DC均發(fā)生了形態(tài)學變化。sCD40L及TNF-α誘導組DC不僅細胞

5、數(shù)量較對照組細胞數(shù)明顯增多，且成簇分布，增大的胞體表面?zhèn)巫銧钔黄鸶鼮槊黠@。
　　 2.sCD40L誘導組DC表達CD80、CD86、MHC(I)、MHC(II)及CD1a的水平明顯高于對照組DC(P＜0.05)。與TNF-α誘導組相比，無明顯差異(P＞0.05)。而sCD40L誘導組和TNF-α誘導組DC表達CD83的水平明顯高于對照組DC(P＜0.01)。同時，sCD40L誘導組DC表達CD83的水平明顯高于TNF-α誘導組。

6、
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示，sCD40L誘導組DC表面表達IFN-γ和IL-12mRNA的水平明顯高于對照組DC(P＜0.01);而表達IL-10及TGF-β1的水平則明顯低于對照組DC(P＜0.01)。
　　 4.ELISA結(jié)果顯示，sCD40L誘導組、TNF-α誘導組和對照組DC培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ的分泌水平分別為322.15±72.10、267.79±45.33、185.65±56.22，細胞因子IL

7、-12的分泌水平分別為133.60±22.17、119.43±15.46、65.89±12.71，細胞因子IL-10的分泌水平分別為97.81±13.45、101.87±16.35、129.67±23.11，細胞因子TGF-β1的分泌水平分別為44.67±7.86、42.24±9.98、96.33±14.57。其中sCD40L誘導組培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-12的含量明顯高于TNF-α誘導組及對照組(P＜0.01);而IL-10及TG

8、F-β1的含量與TNF-α誘導組無明顯差異(P＞0.05)，但明顯低于對照組DC(P＜0.01)。
　　 5.sCD40L組、TNF-α組、對照組DC表達MAPKp38蛋白水平分別是1.24±0.34、0.92±0.27、0.61±0.31。sCD40L組、TNF-α組、對照組DC表達P-STAT1蛋白水平分別是1.17±0.37、0.69±0.28、0.37±0.12。sCD40L組、TNF-α組、對照組DC表達P-STAT3

9、蛋白水平分別是0.99±0.21、0.79±0.18、0.52±0.29。其中TNF-α組、sCD40L組DC中轉(zhuǎn)錄因子MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3蛋白及mRNA的水平均明顯高于對照組(P＜0.01)，同時sCD40L組DC表達上述三類轉(zhuǎn)錄因子的水平明顯高于TNF-α組(P＜0.05)，結(jié)果提示CD40L對DC分化成熟的作用，可能是通過激活MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3信號通路實現(xiàn)的。
　　 6

10、.MTT實驗結(jié)果顯示，當DC(∶)T細胞為1∶80時，sCD40L組DC刺激T細胞增殖的OD值明顯高于對照組（P＜0.01），但與TNF-α組無明顯差異(P＞0.05)。但當DC(∶)T細胞分別為1∶10和1∶40時，sCD40L組DC刺激T細胞增殖的OD值不僅明顯高于對照組(P＜0.01)，也明顯高于TNF-α組(P＜0.05)。
　　 7.ELISA實驗結(jié)果顯示，sCD40L組及TNF-α組MLR體系中IFN-γ的含量明顯高

11、于對照組(P＜0.01)，同時sCD40L組MLR體系中IFN-γ的含量明顯高于TNF-α組(P＜0.05);而sCD40L組及TNF-僅組MLR體系中IL-4的含量則明顯低于對照組(P＜0.01)，而sCD40L組及TNF-α組MLR體系中IL-4的含量，無明顯差異(P＞0.05)。
　　 8.MTT法檢測結(jié)果顯示，當E∶T分別為10∶1及20∶1時，CD40L組及TNF-α組CTL對Hela細胞的殺傷活性均明顯高于對照(P＜

12、0.01)，CD40L與TNF-α組相比，殺傷率雖有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但當E(∶)T為50∶1時，sCD40L組及TNF-α組CTL對Hela細胞的殺傷活性均明顯高于對照組(P＜0.01)，同時，sCD40L組CTL對Hela細胞的殺傷活性明顯高于TNF-α組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CD40L可促進DC成熟，并上調(diào)DC表面CD80、CD86、MHC(I)及MHC(II)、C

13、D1a及CD83分子表達。
　　 2.經(jīng)CD40L刺激后，能夠明顯上調(diào)DC分泌IFN-γ、IL-12的水平，下調(diào)DC分泌IL-10、TGF-β1的水平。其機制可能與影響MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。
　　 3.sCD40L可明顯提高DC誘導同種異體T淋巴細胞增殖的功能，促進DC誘導下，T細胞分泌IFN-γ，抑制其分泌IL-4。
　　 4.經(jīng)sCD40L刺激后的凍融抗原致敏DC可明