1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)涉及多種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此，主要通過研究蛋白質(zhì)間相互作用的分子機(jī)制來揭示神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程。盡管許多蛋白都參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但有研究證實Rab3蛋白和突觸結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。雖然人們對Rab3A和突觸結(jié)合蛋白的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但到目前為止，關(guān)于它們的相互關(guān)系和如何協(xié)同調(diào)控實現(xiàn)突觸囊泡的胞吐作用的分子機(jī)制一直沒有研究清楚。突觸結(jié)合蛋白Ⅰ是突觸結(jié)合蛋白家族中含量最豐富的亞型，在突觸囊泡膜

2、融合和胞吐過程中起著Ca2+感受器的作用。突觸結(jié)合蛋白Ⅰ通過C2結(jié)構(gòu)域與其他分子相互作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程。Rab3A屬于小G蛋白超家族中Rab家族中的一種亞型蛋白，位于大腦神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡上，由220個氨基酸組成，對神經(jīng)遞質(zhì)釋放和膜轉(zhuǎn)運過程起著關(guān)鍵作用。我們的前期研究證明，Rab3A在沒有Ca2+存在時能與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ的C2A和C2B結(jié)構(gòu)域結(jié)合。C2B結(jié)構(gòu)域中的KKKK模體是與Rab3A結(jié)合的關(guān)鍵位點，Rab3A

3、可能和t-SNARE復(fù)合體中的syntaxin競爭性與C2B結(jié)合，從而調(diào)節(jié)Ca2+依賴型的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，但Rab3A與C2A結(jié)構(gòu)域相互作用的分子機(jī)制尚不清楚。
　　為了尋找到突觸結(jié)合蛋白Ⅰ中的C2A結(jié)構(gòu)域與Rab3A相互作用的功能位點和調(diào)控機(jī)制。在本研究中，通過分子克隆技術(shù)將突觸結(jié)合蛋白Ⅰ C2A結(jié)構(gòu)域及其兩個截短突變體C2A(143-206)、C2A(207-244)和三個雙點突變體C2A(R199Q/K200Q)、C2A((R

4、233Q/K236Q)、 C2A(M173Q/F234Q)分別構(gòu)建在表達(dá)載體pGEX4T-1上，得到帶GST標(biāo)簽的融合蛋白，另將Rab3A構(gòu)建到pET28a載體上，獲得His標(biāo)簽的融合蛋白。通過GST pull down實驗，結(jié)果顯示截短突變體C2A(143-206)與C2A(207-244)相比，C2A(143-206)結(jié)合Rab3A能力較強(qiáng)，表明Rab3A與C2A的結(jié)合位點可能位于C2A的N端。進(jìn)一步實驗結(jié)果證明，突變體C2A(R1

5、99Q/K200Q)和野生型C2A相比，其與Rab3A相互作用明顯減弱，而突變體C2A(R233Q/K236Q)和C2A(M173Q/F234Q)與Rab3A結(jié)合能力不變。綜合分析，Rab3A與C2A相互作用的關(guān)鍵結(jié)合位點位于C2A結(jié)構(gòu)域突環(huán)2中的R199K200，該位點與已知的大多數(shù)其他功能位點不相重疊。例如，C2A結(jié)構(gòu)域中鈣離子結(jié)合位點是由天冬氨酸殘基簇決定的;YVK模體是突觸結(jié)合蛋白Ⅰ與突觸融合蛋白及磷脂相互作用的關(guān)鍵位點;疏水性