1、組織因子途徑抑制物一2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)，又稱胎盤蛋白一5(placentaprotein-5，PP-5)和基質相關絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI)，是一種帶有kunitz型結構域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，由于與組織因子途徑抑制物(tissuefactorpathwayinhi

2、bitor,TFPI)的結構非常相似，故此得名。成熟的人TFPI-2(humanTFPI-2，hTFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串聯(lián)的三個kunfiz結構域和富含堿性氨基酸的C端組成，體外實驗發(fā)現(xiàn)它能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等多種蛋白酶的活性，但對凝血因子Vna(FVIIa)／組織因子(tissuefactor,TF)復合物、凝血因子Xa(FXa)、t-PA(tissue-typ

3、eplasminogenactivator)及uPA(urokinase-typevlasminogenactivator)的抑制作用不明顯。 已知TFPI的三個結構域有其各自的功能，如結構域1與FVIIa／TF結合并抑制其功能；結構域2與FXa結合并抑制其功能；結構域3與肝素、CDl4、LRP(10Wdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP)和gp330結合，發(fā)揮抗炎、協(xié)助抗

4、凝、促進TFPI代謝等作用。從理論上推測，hTFPI-2既然與TFPI結構類似，它的三個結構域也應該具有獨立的功能，但這些功能是什么則需要大量的實驗證實。 研究表明hTFPI-2能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤、膠質細胞瘤等多種惡性腫瘤的侵襲轉移，也能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的脫落。因此，hTFPI-2有可能作為一種新型蛋白質藥物，在治療腫瘤轉移和動脈粥樣硬化并發(fā)癥方面具有潛在的應用前景。 但是，TF

5、PI-2的生理功能迄今未知，極大地妨礙了它的應用。由于TFPI-2是一種存在于細胞外基質中的蛋白酶抑制因子，對于細胞外基質的重塑發(fā)揮重要的調節(jié)作用，因此人們認為TFPI-2可能和細胞運動、胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤轉移和動脈粥樣硬化等生理病理過程具有密切的關系。應用分子生物學技術在模式生物中定向敲除(knockout)某個特定基因，然后觀察實驗動物的整體結構、功能和生理狀態(tài)的變化，已成為研究基因功能的重要方法。因此，鑒于TFPI-2的研究

6、現(xiàn)狀，有必要采用模式生物詳細研究TFPI一2的生理功能，從而對該蛋白的理論研究和應用開發(fā)提供更多的理論知識。 我們以人胎盤組織總RNA為模板，用RT-PCR獲得hTFPI-2的cDNA基因，通過與原核表達載體重組，實現(xiàn)了hTFPI-2在大腸桿菌中的高效表達，目的蛋白以包涵體形式存在于菌體內，表達量占全菌總蛋白的20％一30％，經復性、純化后hTFPI-2的純度大于90％，產率約為20-30mg／L。性質研究表明復性后的hTFP

7、I-2具有抑制胰蛋白酶、纖溶酶、MMP-2和MMP-9的活性，同時亦具有抑制纖維肉瘤細胞HT-1080侵襲轉移的能力。 本研究還探索了采用酵母表達系統(tǒng)制備hTFPI-2第一個Kunitz結構域(hTFPI-2／KD)的工藝路線，并在此基礎上研究了hTFPI-2／KDl的功能和結構。研究初期，我們按常規(guī)方法把hTFPI-2／KDl的野生型基因轉入畢赤酵母體內，但表達結果并不理想。在分析了hTFPI-2／KDl編碼序列的特點之后，

8、我們發(fā)現(xiàn)其中含有較多的酵母稀有密碼子，因此推測密碼子的偏好性可能是制約該蛋白在酵母體內表達的原因之一。我們利用PCR的方法按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性優(yōu)化了hTFPI-2／KDl的編碼基因，將其與畢赤酵母表達載體pPIC9K重組，用電轉化的方法使重組質粒轉入畢赤酵母體內，篩選出高拷貝的轉化子。種子菌經兩次放大后，在30L發(fā)酵罐中用甲醇誘導表達，誘導40小時后目的蛋白表達量達到高峰，并且以可溶形式存在于培養(yǎng)上清中。培養(yǎng)上清依次經超濾、分

9、子篩、離子交換等純化步驟進行純化。純化后的目的蛋白純度達到96％，產量為20mg/L左右。發(fā)色底物法檢測顯示，hTFPI-2／KDl對纖溶酶和胰蛋白酶都具有明顯的抑制作用。應用明膠酶譜法觀察到hTFPI-2／KDl對MMP-2和MMP-9均具有抑制作用；Matrigel法觀察到hTFPI-2／KDl能夠降低纖維肉瘤細胞HT-1080的體外侵襲能力。 我們聯(lián)合應用斑馬魚基因組數據庫、生物信息學、RT-PCR和RACE等方法率先克

10、隆了zebrafishTFPI-2(zTFPI-2)的cDNA序列。經過序列分析發(fā)現(xiàn)zTFPI-2同樣具有三個串聯(lián)排列的Kunitz結構域，與人TFPI-2的三個結構域的同源性分別為59％、65％和5l％。在此基礎上，我們采用斑馬魚胚胎整體原位雜交技術(wholemountmsimhybridization)觀察了zTFPI一2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達的時間和空間變化，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期階段就有明顯的表達，雜交信

11、號主要存在于胚胎的頭部和雙側胸鰭，實時定量PCR顯示zTFPI-2的表達水平在成魚各臟器中依次為腦部、心臟、肝、眼和卵巢，初步提示zTFPI-2和這些臟器的功能或發(fā)育可能有比較密切的關系。為觀察zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的作用，我們根據它的基因序列設計了嗎啡琳修飾的反義核酸，采用顯微注射的方法將其注入到斑馬魚受精卵內，使zTFPI-2的表達下調。結果顯示，zTFPI-2下調的斑馬魚胚胎出現(xiàn)頭部變小、卵黃囊增大、心包水腫、中樞神

12、經系統(tǒng)中的神經纖維明顯稀疏、眼底感光細胞排列紊亂等變化，同時伴有雙側胸鰭的發(fā)育顯著減緩。為了進一步研究其中的分子機制，我們采用基因芯片比較了正常和zTFPI-2下調后的胚胎之間基因表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2下調后有近六百個基因發(fā)生了兩倍以上的上調或下調。這些基因涵蓋了結構分子、酶類、第二信使分子、轉錄因子等的編碼基因，其中與胚胎發(fā)育尤其是中樞神經系統(tǒng)發(fā)育關系比較密切的是Notch信號通路中的某些信號分子，如Notchla、mib和