重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用的研究.pdf_第1頁
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1、乳腺癌作為一種高發(fā)性腫瘤,它的預(yù)防和治療在生物界和醫(yī)學(xué)界越來越受到重視,尋求一種新型有效且低毒性的抗乳腺癌藥物迫在眉睫。近年來植物來源的胰蛋白酶抑制劑預(yù)防和抵制癌癥的功能已成為一個(gè)熱點(diǎn)受到特別關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn):來自蕎麥中的重組胰蛋白酶抑制劑rBTI(recombinant buckwheat trypsin inhibitor)可以抑制人類白血病細(xì)胞(K562,HL60)以及人類實(shí)體瘤細(xì)胞 HepG2,EC9706等的增殖,并

2、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但rBTI抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和分子靶點(diǎn)還尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),NFκB/p65信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)展中起著較為關(guān)鍵的作用。為了探究重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑rBTI對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用及其機(jī)制,本研究主要開展以下研究內(nèi)容:
  1、采用MTT法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)rBTI能夠明顯的抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)出一種劑量依賴的方式。劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)表明rBTI可抑制MCF-7細(xì)胞遷

3、移。用不同濃度的rBTI對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理后,通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MCF-7細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯并出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)周期相關(guān)因子p53、CDK1、CDK2及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas、Bax、Bcl-2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)促凋亡基因顯著表達(dá),而抑凋亡基因表達(dá)量明顯減少。
  2、不同濃度的rBTI對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理后,運(yùn)用Weste

4、rn Blot技術(shù)和qRT-PCR對(duì)NFκB/p65途徑中p65、IκBα、IKKα/β在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p65的核轉(zhuǎn)位,結(jié)果顯示IKKα/β表達(dá)量顯著升高、IκBα發(fā)生了明顯的磷酸化,同時(shí)p65蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逐漸減少、在細(xì)胞核內(nèi)逐漸增多。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明rBTI可促使ROS水平升高,當(dāng)NAC將ROS抑制后,可從Western blot結(jié)果看出IκBα的磷酸化情況明顯減小, NF-κB/p6

5、5核轉(zhuǎn)位也相對(duì)減少。說明NF-κB/p65信號(hào)通路的激活與ROS的增加相關(guān)。由此可見,rBTI可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,IκBα的磷酸化降解,從而誘導(dǎo)p65蛋白的核轉(zhuǎn)位,激活NF-κB/p65信號(hào)通路。
  綜上所述, rBTI阻斷MCF-7細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡,可能是通過激活MCF-7細(xì)胞中NFκB/p65信號(hào)通路。
  3、rBTI和紫杉醇都具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用,但兩者聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞

6、的影響尚不明確。本研究通過MTT比色法對(duì)rBTI與紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行檢測(cè);采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡以及ROS水平進(jìn)行檢測(cè);利用qRT-PCR和 Western印跡方法,檢測(cè)rBTI與紫杉醇聯(lián)合作用后凋亡因子表達(dá)情況。結(jié)果表明,rBTI(2.5μM)與紫杉醇(0.05~0.5μM)聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞后,能顯著抑制其增殖。將rBTI與紫杉醇進(jìn)行聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞,誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的凋亡及

7、ROS的產(chǎn)生;同時(shí)與rBTI單獨(dú)作用時(shí)相比,聯(lián)合作用明顯上調(diào)了p53、Bax的表達(dá),促進(jìn)了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核轉(zhuǎn)位;與rBTI組和紫杉醇單獨(dú)作用組相比,兩者聯(lián)合用藥明顯下調(diào)了Bcl-2和Cyclin D1的表達(dá)。本研究證實(shí),rBTI聯(lián)合紫杉醇可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,激活NFκB/p65信號(hào)通路,協(xié)同誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。
  以上研究結(jié)果為rBTI抗乳腺癌作用的研究奠定了基礎(chǔ),為乳腺癌的治療和聯(lián)合用藥提供了

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