1、目的：細(xì)胞自噬是所有真核生物共有的一種保守的代謝途徑，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）及自噬降解底物P62蛋白在細(xì)胞自噬過程中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)通過檢測LC3-Ⅱ及P62蛋白及基因在初診未治急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中的表達(dá)程度了解急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中細(xì)胞自噬的表達(dá)水平的高低，為從新的角度解釋兒童急性白血病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，為兒童急性白血病的治療提供新思路。
　　方法:
　　1免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物

2、酶連結(jié)法（Immunohistochemical streptavidin Perosidase）
　　1.1病例及分組
　　隨機(jī)選取2014年1月至2016年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒科住院確診的初診未治急性白血?。╝cute leukemia，AL）患兒50例作為實(shí)驗(yàn)組，其中急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）30例，包括標(biāo)危13例，中危14例，高危3例，B型ALL24

3、例，T型ALL6例；急性髓細(xì)胞性白血病（acute myelocytic leukemia, AML）20例，其中包括M11例，M25例，M35例,M44例,M53例,M72例；所有AL病例中性別組成為男孩30例，女孩20例，年齡1歲~14歲；所有患兒均經(jīng)臨床表現(xiàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)（Morphology,M）、免疫學(xué)(Immunology,I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytogentics,C)和分子生物學(xué)(Molecular,M)分型（MICM）確診

4、，同時隨機(jī)選取性別和年齡與實(shí)驗(yàn)組相匹配的非惡性血液病患兒20例（其中包括免疫性血小板減少癥患兒14例，營養(yǎng)性貧血患兒6例）作為對照組。
　　1.2標(biāo)本采集及處理
　　分別抽取實(shí)驗(yàn)組及對照組患兒骨髓液2ml，放入玻璃管中自然凝固，凝固后倒入含有4％多聚甲醛的玻璃瓶中保存?zhèn)溆?。之后石蠟包埋，將蠟塊取4um厚連續(xù)切片，HE染色觀察每個標(biāo)本中白血病細(xì)胞數(shù)約占有核細(xì)胞總數(shù)的50%至95%，標(biāo)本合格，行免疫組織化學(xué)法檢測LC3-Ⅱ及P6

5、2蛋白的表達(dá)水平。切片采用盲法由研究者閱片。LC3-Ⅱ與P62蛋白均參照Fromowitz陽性細(xì)胞半定量分級法的判斷方法，隨機(jī)選取5個高倍視野（×400），每個視野細(xì)胞數(shù)不少于100個，細(xì)胞數(shù)過少的可選取10個高倍視野（×400），計(jì)數(shù)白血病細(xì)胞總數(shù)及白血病陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞漿或者細(xì)胞核里出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)切片中陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率和染色深度分別進(jìn)行評估。
　　2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（reverse transcrip

6、tion-PCR，RT-PCR）
　　另選取2014年1月至2015年5月經(jīng)上述方法確診的初診未治急性白血病患兒20例作為實(shí)驗(yàn)組，其中ALL患兒12例，AML患兒8例，及同期非惡性血液病患兒12例（包括免疫性血小板減少癥患兒7例，營養(yǎng)性貧血患兒5例）作為對照組，分別抽取骨髓液0.5ml行RT-PCR檢測LC3-Ⅱ及P62的mRNA表達(dá)水平。標(biāo)本經(jīng)過RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等步驟電泳后經(jīng)紫外燈檢測。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)方

7、法
　　免疫組化資料采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間LC3-Ⅱ和P62蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)， LC3-Ⅱ和P62蛋白間的相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR實(shí)驗(yàn)資料采用Graphpad prism5.0,實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1免疫組化法:LC3-Ⅱ蛋白和P62蛋白陽性染色為棕色至棕褐色顆粒， L

8、C3-Ⅱ位于細(xì)胞漿及部分細(xì)胞核中，P62位于細(xì)胞漿中。
　　1.1 LC3-Ⅱ蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對照組兒童中陽性表達(dá)率分別為66.00%
　?。?3/50）及15.00%（3/20），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P62蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對照組兒童中陽性表達(dá)率分別為76.00%（38/50）及55.00%（11/20），其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　1.2 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及對照組兒童中陽性表

9、達(dá)率分別為63.33%（19/30）及15.00%（3/20），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P62蛋白在ALL兒童及對照組中陽性表達(dá)率分別為73.33%（22/30）及55.00%（11/20），其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　1.3 LC3-Ⅱ蛋白在AML兒童及對照組兒童中陽性表達(dá)率分別為70.00%（14/20）及15.00%（3/20），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P62蛋白在AML兒童及對

10、照組兒童中陽性表達(dá)率分別為80.00%（16/20）及55.00%（3/20），其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　1.4 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽性表達(dá)率分別為63.33%（19/30）及70.00%（14/20）；P62蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽性表達(dá)率分別為73.33%（22/30）及80.00%（16/20），其差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　1.5 LC3-Ⅱ蛋白在男

11、性AL、ALL及AML兒童中陽性表達(dá)率分別為66.67%（20/30）、60.00%（12/20）及80.00%（8/10），LC3-Ⅱ蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽性表達(dá)率分別為65.00%（13/20）、70.00%（7/10）、60.00%（6/10），在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中，男性與女性LC3-Ⅱ蛋白陽性表達(dá)率的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；P62蛋白在男性AL、ALL及AML兒童中陽性表達(dá)率

12、分別為80.00%（24/30）、75.00%（15/20）、90.00%（9/10），P62蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽性表達(dá)率分別為70.00%（14/20）、70.00%（7/10）、70.00%（7/10），在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中，男性與女性P62陽性表達(dá)率的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。1.6 LC3-Ⅱ蛋白在B型及T型ALL兒童中陽性表達(dá)率分別為66.67%（16/24）及50.00%

13、（3/6），其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；P62蛋白在B型及T型ALL兒童中陽性表達(dá)率分別為75.00%（18/24）及66.67%（4/6），其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　1.7經(jīng)spearman相關(guān)性分析，AL兒童中LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（rs=0.249，P=0.103，P>0.05）。
　　2 RT-PCR檢測結(jié)果：
　　LC3-Ⅱ基因在實(shí)驗(yàn)組及對照組中的表達(dá)均呈

14、正太分布，實(shí)驗(yàn)組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為0.360±0.047，對照組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.107±0.136，兩樣本比較t=5.169，P=0.000，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P62在兩組數(shù)據(jù)中的表達(dá)均呈正太分布，實(shí)驗(yàn)組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.336±0.139，對照組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.610±0.449，兩樣本比較t=0.583，P=0.570，P>0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1自噬相關(guān)基因及蛋白LC

15、3-Ⅱ在急性白血病中表達(dá)上調(diào)，提示急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中細(xì)胞自噬的表達(dá)水平升高，這可能與白血病發(fā)病有關(guān)。
　　2 LC3-Ⅱ及P62蛋白在AML與ALL和男性與女性兒童AL中表達(dá)水平的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在B型及T型ALL兒童中的陽性率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示細(xì)胞自噬表達(dá)水平的高低可能與兒童急性白血病的種類、性別及ALL的免疫表型均無明顯關(guān)系。
　　3 Spearman相關(guān)性分析顯示，AL兒童中LC3-Ⅱ與P62