1、背景：
　　放療是腫瘤綜合性治療中不可或缺的核心技術(shù)之一，在對(duì)腫瘤的局部控制中，輻照不可避免的會(huì)對(duì)腫瘤周圍的正常組織造成損傷。為降低輻照對(duì)正常組織的損傷，輻照的劑量和時(shí)間會(huì)受到嚴(yán)格限制，在一定程度上也制約了放療的治療效果。多葉準(zhǔn)直器、精確的固定技術(shù)、輻射防護(hù)劑等常用來減輕放射性損傷，但是效果并不理想，并且輻射防護(hù)劑缺乏靶向性，同時(shí)也會(huì)對(duì)腫瘤組織起到保護(hù)作用，從而降低了放療的效果。放療增敏劑也存在類似的問題，在對(duì)腫瘤起到放療增敏效應(yīng)

2、的同時(shí)，往往也會(huì)增強(qiáng)照射野內(nèi)正常組織的敏感性，導(dǎo)致放射損傷加重。
　　基因治療是目前腫瘤治療的熱點(diǎn)，通過激活抑癌基因、引入細(xì)胞毒性基因、阻斷癌基因、提高腫瘤免疫原性、改變腫瘤微環(huán)境等策略起到有效的抑瘤作用。SOD2是定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)的超氧化物歧化酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，是細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的重要機(jī)制，也被視為效果確切的輻射防護(hù)劑。另有多項(xiàng)研究表明，SOD2具有抑癌基因的作用，能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并且能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治

3、療的敏感性。然而，由于目前缺乏靶向輻射野的有效基因轉(zhuǎn)染方法以及對(duì)導(dǎo)入的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而限制了SOD2基因治療在臨床的推廣應(yīng)用。
　　Egr-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有6個(gè)CArG盒，該區(qū)域?yàn)檩椪照T導(dǎo)調(diào)控序列，可直接感受輻照刺激。構(gòu)建含有CArG盒的嵌合啟動(dòng)子，可以優(yōu)化啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率，降低本底表達(dá)。通過構(gòu)建下游連接SOD2基因的輻射誘導(dǎo)型嵌合啟動(dòng)子，有望通過控制輻照劑量和時(shí)間對(duì)SOD2基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控，賦予SOD2基因治療

4、時(shí)空限制性表達(dá)的特點(diǎn)。
　　目的：
　　為解決目前放療增敏中“增敏腫瘤和正常損傷加重并存”的臨床難題，本課題嘗試構(gòu)建輻照誘導(dǎo)型嵌合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 SOD2慢病毒過表達(dá)載體，通過控制輻照的劑量和時(shí)間，不僅可以實(shí)現(xiàn)靶向性、可調(diào)控性基因治療，還同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的放療增敏作用和對(duì)正常組織的輻射保護(hù)作用。這樣在腫瘤放療時(shí)兼有保護(hù)正常組織和抑制腫瘤細(xì)胞的作用，不僅可以提高腫瘤的放射治療的效果，還能減低放療對(duì)正常組織的損傷，提高腫瘤患者的生存

5、質(zhì)量；鑒于此，靶向SOD2的基因治療有望在今后的腫瘤放射治療中有較好的應(yīng)用前景。
　　方法：
　　1.含有報(bào)告基因和治療基因的慢病毒制備：
　　全基因合成含有CArG盒-CMV基礎(chǔ)啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子片段，以慢病毒載體pLVX-AcGFP1-N1為骨架，分3步克隆策略構(gòu)建輻照誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因慢病毒載體 pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP1和報(bào)告基因慢病毒載體pLVX-C9BC-AcGFP1-N1。

6、經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功后，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的stbl3菌株，去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒，以293FT細(xì)胞株為工具細(xì)胞，三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝，測(cè)定病毒滴度。
　　2.嵌合啟動(dòng)子的輻射誘導(dǎo)特性和量化調(diào)控特征：
　　報(bào)告基因慢病毒和治療基因慢病毒分別感染HT-29細(xì)胞株和CCD841 CoN細(xì)胞株，藥物篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以不同的照射劑量處理穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，不同時(shí)間點(diǎn)觀察HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株報(bào)告基因和治療基

7、因的表達(dá)，以明確輻照誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性和特點(diǎn)。
　　3.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株輻射處理后SOD2表達(dá)及表型變化：
　　HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株輻照處理后，檢測(cè)下游治療基因SOD2的表達(dá)；觀察不同處理組的細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、凋亡的變化。
　　4.輻射啟動(dòng)SOD2基因治療裸鼠移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究：
　　首先用 HT-29細(xì)胞株建立BALB/c裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型構(gòu)建成功后，局部注射治療基因慢病毒并在72h后

8、給予輻照處理，觀察治療基因表達(dá)情況以及腫瘤生長(zhǎng)曲線、組織病理學(xué)變化和原位凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建報(bào)告基因慢病毒pLVX-C9BC-AcGFP1-N1和治療基因慢病毒 pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP1，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確。病毒包裝后測(cè)定滴度在5×108TU/ml以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。嘌呤霉素藥物篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，擴(kuò)增培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩?br>　　2. HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)表

9、明，輻照誘導(dǎo)型嵌合啟動(dòng)子能在2Gy照射下有效啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，照射處理后24h報(bào)告基因AcGFP1和治療基因SOD2表達(dá)量開始增加，至48h接近平臺(tái)期。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含治療基因的HT-29穩(wěn)轉(zhuǎn)株在6Gy輻照處理后，SOD2表達(dá)明顯增高，細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)較之于對(duì)照組明顯受到抑制，凋亡比率增加。含治療基因的CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在輻照處理后，SOD2表達(dá)明顯增高，較之于對(duì)照組細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)受到較小抑制，凋亡比率相對(duì)

10、較低。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，成功建立HT-29 BALB/c裸鼠移植瘤模型，分組后給予慢病毒注射，72h進(jìn)行6Gy局部照射處理。觀察發(fā)現(xiàn)，較之于對(duì)照組荷瘤裸鼠，注射治療基因慢病毒的裸鼠局部輻照后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)SOD2表達(dá)水平顯著增高，腫瘤生長(zhǎng)遲緩，凋亡細(xì)胞增多；注射治療基因的皮膚組織凋亡細(xì)胞減少。
　　結(jié)論：
　　由串聯(lián)的CArG盒和CMV基礎(chǔ)啟動(dòng)子構(gòu)成的嵌合型啟動(dòng)子具有明顯的輻射誘導(dǎo)特性，在輻射處理下能有效啟動(dòng)下游基因的