1、第一部分大網膜中脂肪來源的間充質干細胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　不同來源大網膜脂肪來源的間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　方法:
　　1.取確診卵巢癌且有大網膜轉移灶，確診卵巢癌無大網膜轉移灶和因婦科良性疾病行手術治療病人的大網膜標本，做ADSCs原代培養(yǎng)。
　　2.脂肪干細胞成脂肪、成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后行

2、油紅O和茜素紅S染色。
　　3.流式細胞學檢測細胞表面標記物CD90，CD105，CD73和CD34的表達。
　　4. ADSCs（P3-5）每日行細胞計數，觀察不同來源的ADSCs的增殖情況。
　　5.細胞組織化學法檢測三組ADSCs中α-SMA的表達。
　　結果:
　　1.光鏡下原代培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細胞樣漩渦狀生長。
　　2.分化誘導21天后，油紅O染色可見鮮紅色油滴，茜素紅S染色可見紅色

3、鈣結節(jié)。
　　3.流式細胞學檢測原代培養(yǎng)的ADSCs表達間充質細胞表面標記 CD90、CD105和CD73，并不表達造血及內皮來源細胞表面標記CD45、CD14和CD34。
　　4.有網膜轉移的卵巢癌病人網膜ADSCs（pmADSCs）比正常大網膜中ADSCs和無網膜轉移的卵巢癌病人網膜ADSCs（pADSCs）的生長速度顯著增快。
　　5.正常大網膜中ADSCs很少表達α-SMA，無網膜轉移的卵巢癌病人網膜ADSCs

4、部分表達α-SMA，有網膜轉移的卵巢癌病人網膜ADSCs大量表達α-SMA。
　　結論:
　　所有來源培養(yǎng)的ADSCs具有干細胞標準形態(tài)和多向分化能力，且純度大于95％，脂肪干細胞α-SMA的表達與卵巢癌發(fā)生和轉移可能有相關性。
　　第二部分網膜脂肪干細胞在卵巢癌細胞的作用下向腫瘤相關成纖維細胞轉化及其機制
　　目的:
　　探討ADSCs是否能向CAFs方向分化以及相關激活機制。
　　方法:
　

5、　1.免疫熒光檢測與EOC細胞直接共培養(yǎng)的ADSCs細胞內α-SMA的表達情況。
　　2.免疫組化法檢測與EOC細胞間接共培養(yǎng)的ADSCs細胞內α-SMA的表達情況。
　　3.應用不同濃度的轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）處理ADSCs1d至8d，取ADSCs做Western blot檢測α-SMA和FAP的表達。
　　4.用 TGF-β1受體抑制劑（A83

6、-01）處理ADSCs，再與SKOV3細胞共培養(yǎng)或外源性
　　TGF-β1處理，取ADSCs做免疫組化、Western blot檢測α-SMA和FAP的表達。
　　結果:
　　1.與EOC細胞直接共培養(yǎng)后的ADSCs細胞發(fā)生分化，高表達CAFs標記物α-SMA。
　　2.與EOC細胞間接共培養(yǎng)后的ADSCs細胞發(fā)生分化，高表達CAFs標記物α-SMA。
　　3.我們應用不同濃度的人重組TGF-β1細胞因子（

7、0.1-10ng/ml）處理ADSCs發(fā)現(xiàn)從1ng/ml起人重組TGF-β1細胞因子可使ADSCs中α-SMA的表達明顯增高且伴隨著 FAP表達的升高（P<0.001）。
　　4.應用2ng/ml TGF-β1作用于ADSCs，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)作用2d后可見α-SMA的表達增高（P<0.01）；作用4d后α-SMA和FAP的表達明顯增多（P<0.001）。
　　結論:
　　我們研究發(fā)現(xiàn)大網膜AD

8、SCs可以向CAFs方向分化，這可能與TGF-β信號通路的激活和MMPs的升高相關。
　　第三部分網膜脂肪來源的間充質干細胞促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲及其機制研究
　　目的:
　　探討正常大網膜人脂肪來源的間充質干細胞對上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響，正常網膜ADSCs促進上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲的機制。
　　方法:
　　1.建立ADSCs與上皮性卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2直

9、接以及間接共培養(yǎng)模型。
　　2. EdU法檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與ADSCs共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞株的DNA復制情況，用腫瘤相關的成纖維細胞(Carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　3. CFSE標記流式細胞學檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與脂肪干細胞共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞株的增殖指數（proliferation index，PI），用

10、與CAFs共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　4. Transwell法檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與脂肪干細胞共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞的侵襲能力，用與CAFs共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　5.懸液芯片技術檢測單獨培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3培養(yǎng)上清中MMPs的表達。
　　6.Western blot檢測卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2與正常脂肪干細胞間

11、接共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)后基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP2）和基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP9）的表達。
　　7.免疫組織化學染色檢測卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2與正常脂肪干細胞間接共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)MMP2和MMP9的表達。
　　結果:
　　1.間接共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞 EdU陽性細胞

12、的比例分別增加 SKOV32.56，A27802.34，CAOV34.57，ES22.27倍；直接共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞株中EdU陽性細胞比例均增加約2倍（P＜0.001）。
　　2. CFSE標記流式細胞學檢測與ADSCs間接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞株PI分別增加SKOV37.67(P＜0.001）, A27803.14(P＜0.001）, CAOV34.97(P＜0.001）及ES26.62倍(P＜0.001）；直接共培

13、養(yǎng)后PI分別增加5.66,4.50,3.59及4.33倍(allP＜0.001）。
　　3. Transwell法檢測與單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株相比，與 ADSCs直接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞SKOV3, A2780, CAOV3和ES2侵襲能力分別增加5.66,4.50,3.59和4.33倍(allP＜0.001），間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞侵襲能力分別增加5.04,8.11,2.10和3.36倍(all P＜0.001）。
　　4

14、.與ADSCs間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3的培養(yǎng)上清較單獨培養(yǎng)的上清，MMP1，2，3，7，9的濃度均上升的6倍以上，其中MMP2上升最大，高達80倍。
　　5.與ADSCs間接共培養(yǎng)后，Western Blot檢測到卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2中MMP2和MMP9的表達量明顯上升(P＜0.001）。
　　6.細胞免疫組織化學染色也顯示ADSCs間接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞MMP2，MM

15、P9的染色強度與染色面積增大( P＜0.001＝。
　　結論:
　　大網膜ADSCs有助于卵巢癌細胞的生長和侵襲，ADSCs明顯增加了卵巢癌細胞MMPs的表達和分泌，這可能是其促進卵巢癌細胞增殖和侵襲的機制之一。
　　第四部分網膜脂肪干細胞向腫瘤相關成纖維細胞分化并促進卵巢癌細胞的生長和轉移的體內研究
　　目的:
　　探討ADSCs在裸鼠腹腔移植瘤和原位移植瘤中，向腫瘤相關成纖維細胞分化并促進卵巢癌細胞的增

16、殖和侵襲的作用。
　　方法:
　　1.建立卵巢癌裸鼠腹水瘤模型，分為六組，每組6只裸鼠，均腹腔注射SKOV3細胞，分別伴隨注射無菌 PBS、ADSCsα-SMA+、ADSCs、ADSCs+A83-01、CAFs和CAFs+A83-01。28天后處死裸鼠，評價腹水腫瘤結節(jié)重量和數量，異種移植瘤行常規(guī)HE染色和免疫組織化學染色檢測α-SMA、MMP2和MMP9的表達。
　　2.建立卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型，裸鼠麻醉后卵巢包

17、囊內原位注射SKOV3luc，接種后第7天活體成像鑒定建模成功后，隨機分為五組，每組6只裸鼠，分別腹腔注射無菌PBS、ADSCs、ADSCsα-SMA+、ADSCs+A83-01和CAFs，每周活體成像檢測卵巢癌原位瘤的生長轉移情況。28天后處死裸鼠，異種移植瘤行常規(guī)HE染色和免疫組織化學染色檢測Ki67、α-SMA、MMP2和MMP9的表達。
　　結果:
　　1.卵巢癌裸鼠腹水瘤模型中發(fā)現(xiàn)伴隨注射了ADSCs和CAFs的裸

18、鼠腹腔腫瘤灶重量明顯多于單獨注射組、α-SMA的表達面積明顯增多，且A83-01也能阻斷EOC細胞對ADSCs的誘導作用和ADSCs的腫瘤促進作用（P＜0.001）。移植瘤組織中MMP2和MMP9的表達也在伴隨注射ADSCs和CAFs時明顯增多。
　　2.我們對原位瘤生物發(fā)光信號進行分析，發(fā)現(xiàn)ADSCs能明顯促進卵巢癌的生長和轉移（P＜0.001），并且應用A83-01阻斷TGF-β1通路能夠抵消ADSCs對卵巢癌細胞的促進作用，

19、接種之前與EOC共培養(yǎng)與否（ADSCsα-SMA+）并不影響ADSCs的腫瘤促進作用，CAFs的作用與ADSCs類似。
　　3. ADSCs和CAFs組原位瘤組織中Ki67表達量及強度明顯高于對照組，提示腫瘤生長迅速；ADSCs和CAFs組α-SMA、MMP2和MMP9的表達明顯高于對照組，且阻斷TGF-β1通路能明顯減少其表達。
　　結論:
　　網膜ADSCs可以通過激活TGF-β1信號通路向CAFs方向分化，網膜A