1、蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導調(diào)節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、細胞的生長發(fā)育、基因表達、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，甚至癌變等，在信號傳導過程中占有極其重要的地位。信號傳導是維系外部刺激與細胞反應的橋梁。蛋白質(zhì)在體內(nèi)可逆的磷酸化和去磷酸化過程通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構象的變化或蛋白之間相互作用，對生理過程起到類似“開關”的調(diào)節(jié)作用。
　　從20世紀90年代以來，隨著計算機科學的發(fā)展，生物信息學得到了迅猛

2、的發(fā)展，而蛋白質(zhì)作為生物信息學研究的一個重要對象，有關蛋白質(zhì)的理論模擬已經(jīng)成為一個重要的研究領域。應用分子模擬的方法構建蛋白質(zhì)三維模型，研究生物大分子的結構特點，分析蛋白質(zhì)與底物相互作用，描述蛋白質(zhì)的生化機理已經(jīng)成為進行生物學和醫(yī)學研究的一個主要手段。除了常規(guī)分子動力學模擬外，近年發(fā)展起來的拉伸分子動力學模擬通過引入外加力(勢場)和減少蛋白質(zhì)構象空間自由度等策略，使分子動力學應用范圍更廣。自由能計算方法為蛋白質(zhì)構象變化提供定量的描述，對

3、反應發(fā)生的路線和機理提供依據(jù)。
　　本論文選取兩個磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)構象變化和功能的體系作為研究對象，通過常規(guī)分子動力學模擬、拉伸分子動力學模擬和自由能計算三種方法相結合的手段，研究在蛋白質(zhì)特定位點進行磷酸化以后，對蛋白質(zhì)構象變化以及蛋白質(zhì)之間結合情況帶來的影響，及調(diào)控蛋白功能的分子機制。
　　1.Set88位磷酸化調(diào)控LC8解離機理的理論研究
　　動力蛋白輕鏈是一類序列高度保守的蛋白質(zhì)，在生理條件下以二聚體形式存在，參

4、與一系列細胞內(nèi)重要的生理過程。有實驗證明，在細胞內(nèi)動力蛋白輕鏈LC8的二聚體結構可以被蛋白激酶在Ser88位點磷酸化，導致二聚體解離，對哺乳細胞凋亡過程起到抑制作用。但從生化實驗里面無法得到磷酸化的細節(jié)和對二聚體結構的影響，以及引起二聚體解離的機理。我們采用分子動力學模擬和自由能計算相結合的方法，為磷酸化導致LC8解離的機理提供了原子尺度的解釋。
　　10ns常規(guī)分子動力學模擬結果表明當在Ser88發(fā)生突變或磷酸化(S88E/pS

5、er88)時，Ser88附近的殘基和一些相互作用受到擾動。突變使原本緊密結合的Ser88和Ser88’由于同性負電荷的引入而互相排斥，原有的較為牢固的氫鍵作用被打破。同時，由于位于二聚體結合界面負電荷的引入，使蛋白局部極性增加，從而吸引周圍溶劑中的水分子靠近表面，為水分子進入疏水結合界面打開了一個通道。從模擬的結果很清晰的看到，在突變體中水分子由C-端Glu88/pS88位置進入結合界面，通過與His55的側鏈相互作用，干擾圍繞His5

6、5周圍的氫鍵網(wǎng)絡。由于His55不再包埋在疏水界面內(nèi)，而是更多的暴露在水環(huán)境中，從而導致其側鏈pKa值增大，增加它的質(zhì)子化幾率。而以往的研究已經(jīng)表明His55的質(zhì)子化能夠使二聚體結構失去穩(wěn)定性。因此我們的研究表明，LC8在Ser88磷酸化導致二聚體結構解離的過程是通過間接調(diào)節(jié)His55的質(zhì)子化狀態(tài)來實現(xiàn)的。
　　自由能計算給出了由Ser88磷酸化引起二聚體結構穩(wěn)定性下降的能量數(shù)據(jù)。S88E體系的△△GDisso是-6.6kcal/

7、mol，與實驗測得的結果(-8.1kcal/mol)符合的較好。我們的計算還給出了實驗中難以檢測到的pSer88體系的△△GDisso為-50.8kcal/mol。通過對自由能結果的進一步分析，發(fā)現(xiàn)自由能變化主要是由帶負電的pSer88靜電排斥作用引起，靜電自由能變化項占主導作用，與實驗結果吻合較好。以上結果都說明，對Ser88進行磷酸化確實會影響LC8二聚體的穩(wěn)定性，使其更易發(fā)生解離。
　　2.磷酸化調(diào)控ZO-1PDZ2與Cx4

8、3結合機理的研究
　　ZO-1PDZ2結構域與連接蛋白(Connexin43，Cx43)的相互作用近年來廣受關注，因為它們的相互作用在諸如心肌細胞、成纖維細胞和神經(jīng)元細胞等諸多細胞中起到調(diào)節(jié)相鄰細胞間隙聯(lián)結(Gapjunction，GJ)的位置、移動和動態(tài)連接模式的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在Cx43靠近C-端的S(-9)位被激酶磷酸化以后，Cx43與ZO-1PDZ2結構域的結合被打斷，PDZ2組裝Cx43形成六聚體GJ的功能消失，但是機理

9、尚不明確。
　　我們采用分子動力學模擬的方法對ZO-1PDZ2結合Cx43體系進行系統(tǒng)的研究，共研究了包括FreeFrom(PDZ2未結合Cx43)、ShortForm(PDZ2結合Cx43靠近C-端的9個殘基的肽段體系)、LongForm(PDZ2結合Cx43靠近C-端的12個殘基的肽段體系)、LongS(-9)(在LongForm基礎上對S(-9)進行磷酸化的體系)和LongS(-9，-10)(在LongForm基礎上同時對S

10、(-9，-10)進行磷酸化的體系)。
　　研究結果表明，無論是否結合Cx43肽段以及肽段長短、是否被磷酸化，ZO-1PDZ2二聚體結構都具有較大的柔性，兩個單體以兩條反平行的β-鏈相互作用的結合中心為中點，兩個單體的相對位置在模擬過程中在一定幅度內(nèi)振動，單體本身不發(fā)生大的構象變化。四個結合肽段體系中，Cx43肽段與PDZ2二聚體有不同的結合強度和結合模式。通過比較X-ray晶體結構(ZO-1PDZ2結合9個氨基酸Cx43肽段體系，

11、ShortForm)和ZO-1PDZ2結合12個氨基酸Cx43肽段(LongForm)結合情況發(fā)現(xiàn)，ShortForm體系中，Cx43肽段N-端脫離于PDZ2表面的結合，向自身C-端折疊形成發(fā)卡狀構象，而LongForm體系中肽段則與PDZ2形成穩(wěn)定的結合，說明在ShortForm中Cx43的N-端增加的三個氨基酸ASS對于穩(wěn)定Cx43在PDZ2上的結合有不可忽略的重要性。對LongForm體系的S(=9)做磷酸化突變，或者同時磷酸化S