1、蛋白質(zhì)是生物體各種生理過程的主要執(zhí)行者。在生理條件下，不同蛋白質(zhì)特定序列的氨基酸長鏈能夠折疊成特定的三維結(jié)構，行使其生理功能。因此漫長的進化過程必然使蛋白質(zhì)的結(jié)構具有功能意義。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構測定技術的日益成熟，越來越多的蛋白質(zhì)三維結(jié)構被解析出來，這些結(jié)構信息揭示了很多重要生理過程的分子機制，也為藥物的研制提供了關鍵的理論基礎。然而，隨著當前結(jié)構生物學和生物物理化學的逐步深入發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)僅有蛋白質(zhì)三維結(jié)構的信息往往不足以理解其生物學功能

2、。這是因為結(jié)構解析給出的是單一的一個靜態(tài)結(jié)構(如晶體結(jié)構)，而蛋白質(zhì)在行使其生理功能時往往會發(fā)生構象變化，產(chǎn)生一系列瞬態(tài)構象。換言之，溶液中的蛋白質(zhì)作為一種軟物質(zhì)可以在其平衡構象附近振蕩，甚至可以遠離平衡構象，而晶體結(jié)構得到的只是蛋白質(zhì)勢能面上的一個點。要全面理解蛋白質(zhì)的功能和揭示生理過程的分子機制我們不但需要了解蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構，更需要了解蛋白質(zhì)的結(jié)構柔性和各個瞬態(tài)構象之間的轉(zhuǎn)換，即動力學性質(zhì)。因此需要在傳統(tǒng)的結(jié)構生物學研究中加入時間

3、的維度，將結(jié)構一功能關系擴展到結(jié)構-動力學-功能關系的研究。蛋白質(zhì)動力學行為的時間尺度很寬，其涵蓋范圍從快速而局部性的原子波動到慢速而整體性的諸如蛋白質(zhì)折疊的構象變化。許多蛋白質(zhì)分子實現(xiàn)其生物功能時都需要發(fā)生大幅度的構象變化，比如通過線團(loop)結(jié)構的擺動和二級結(jié)構單元的運動實現(xiàn)對活性位點構象的調(diào)整或者對底物分子進行識別，這類運動的時間尺度大致在納秒到微秒(10-9到10-6秒)級別，運動幅度一般在1到5 A。更復雜的運動則往往需要

4、通過結(jié)構域的整體運動來完成，這種結(jié)構域間的相對轉(zhuǎn)動和平動的時間尺度大致在微秒到毫秒(10-6到10-3秒)級別，運動幅度一般會達到5到10 A左右。各時間尺度上的運動從原子振動到大幅度的蛋白整體運動會發(fā)生相互耦合，使得對蛋白質(zhì)動力學和功能關系的研究變得越發(fā)復雜。
　　和實驗手段相比，計算機模擬方法在研究蛋白質(zhì)動力學方面具有獨特的優(yōu)勢。只要有一個高精度的蛋白質(zhì)實驗結(jié)構作為起點，計算方法就能夠“全面”地描述蛋白質(zhì)的動力學(以分子動力學

5、模擬為代表)，我們可以跟蹤單個蛋白質(zhì)分子在每個時刻每個原子的精確位置和相應的能量。盡管蛋白質(zhì)不同的構象狀態(tài)和它們之間的轉(zhuǎn)換速率可以通過實驗方法檢測，但是對構象之間轉(zhuǎn)換路徑上各個狀態(tài)的高精度描述卻是實驗無法達到的，因為這些狀態(tài)都是壽命很短，出現(xiàn)幾率很低的高能構象。計算方法則可以克服這些局限。另一方面，計算機模擬中包含了體系粒子之間的所有相互作用力和相應的能量，因此盡管實驗方法可以告訴我們蛋白質(zhì)怎樣運動，計算方法卻可以告訴我們蛋白質(zhì)為什么這

6、樣運動。目前計算方法的主要缺陷是傳統(tǒng)的分子動力學方法能夠模擬的動力學時間尺度是皮秒到納秒范圍，對蛋白質(zhì)的一些慢速(微秒到毫秒)構象變化過程的模擬則非常困難。為了克服這一困難，計算生物學家發(fā)展了多種方法和策略來簡化力場或施加外力以加速構象變化過程。
　　我們選取了三個大小構造不一但都能夠發(fā)生大尺度構象變化的蛋白質(zhì)體系來研究結(jié)構單元和構象變化之間的關系。這些體系包括含有四個結(jié)構域的ABC轉(zhuǎn)運體蛋白輸入體BtuCD和輸出體MsbA、PS

7、D-95蛋白中含有兩個結(jié)構域的串列體PDZ12以及脂質(zhì)化修飾的膜融合SNARE蛋白Ykt6。在實際應用過程中，除了常規(guī)分子動力學模擬之外我們也使用了靶向分子動力學模擬和正則模式分析的方法，分別通過外加力場加速構象變化以及分析局域勢能面形態(tài)的方式來獲得蛋白質(zhì)體系大幅度構象變化的信息。
　　ABC轉(zhuǎn)運體蛋白超家族在生物體中能夠利用筒ATP分子結(jié)合和水解的能量實現(xiàn)底物分子跨細胞膜的轉(zhuǎn)運。轉(zhuǎn)運的過程需要發(fā)生大幅度的構象變化，在面向內(nèi)(in

8、ward-facing)構象(孔道向內(nèi)打開向外關閉)和面向外(outward-facing)構象(孔道向內(nèi)關閉向外打開)之間切換。ABC轉(zhuǎn)運體蛋白由兩個跨膜結(jié)構域與兩個核苷結(jié)合結(jié)構域組成，其運作的核心機制在于其跨膜結(jié)構域與核苷結(jié)合結(jié)構域的運動耦合。前者內(nèi)部底物轉(zhuǎn)運孔道的開閉和后者在ATP分子的結(jié)合和水解時表現(xiàn)出的二聚和解離貫穿著整個底物轉(zhuǎn)運的過程。就此，我們以BtuCD輸入體和MsbA輸出體為研究對象采用了正則模式分析和靶向分子動力學模

9、擬的方法進行了研究。
　　維生素B12輸入體BtuCD蛋白具有20個跨膜螺旋，孔道的大部分由一對。TM5螺旋組成，而跨膜結(jié)構域則通過L線團結(jié)構與核苷結(jié)合結(jié)構域相連。我們發(fā)現(xiàn)不論是從面向外到面向內(nèi)還是從面向內(nèi)到面向外的構象變化過程，核苷結(jié)合結(jié)構域的運動總會通過L線團與轉(zhuǎn)運孔道細胞內(nèi)側(cè)端的運動同步進行。在從面向外構象到面向內(nèi)構象的變化中，核苷結(jié)合結(jié)構域的打開會導致L線團的打開，繼而引起孔道主體TM5螺旋細胞內(nèi)側(cè)端的打開。其逆過程也基本

10、相似。同時，我們也發(fā)現(xiàn)正逆向的變化過程并沒有經(jīng)歷同一條構象轉(zhuǎn)化路徑，而是存在著一定的差異。在正方向過程中，TM5螺旋內(nèi)側(cè)端會平穩(wěn)地經(jīng)由對稱運動的方式打開，而逆方向過程則往往會有一段更明顯的非對稱運動階段。我們的研究揭示了BtuCD蛋白各個結(jié)構域構象變化之間的耦合關系，給出了BtuCD輸入體轉(zhuǎn)運機制的詳細圖像，并特別指出了從面向內(nèi)到面向外的變化過程會經(jīng)歷一個非對稱的中間狀態(tài)。
　　MsbA蛋白是細菌中脂質(zhì)A和脂多糖分子的輸出體。它與

11、多類藥物抗性蛋白P糖蛋白序列高度同源且結(jié)構相似，對它的轉(zhuǎn)運機理的研究將為癌癥治療藥物的設計提供直接的參考依據(jù)。通過研究其面向外到面向內(nèi)的構象變化過程我們再度證實了核苷結(jié)合結(jié)構域與跨膜結(jié)構域的耦合機制，但其具體的構象變化過程與BtuCD體系完全不同。核苷結(jié)合結(jié)構域的打開變化首先會經(jīng)過序列高度保守的X線團抵達孔道細胞內(nèi)側(cè)端的四螺旋束，然后隨著四螺旋束的打開再經(jīng)由跨膜螺旋TM6將細胞內(nèi)側(cè)的變化情況向細胞外側(cè)傳遞。在轉(zhuǎn)運過程中各結(jié)構單元緊密配合

12、，由核苷結(jié)合結(jié)構域開始經(jīng)由X.線團、四螺旋束以及跨膜螺旋TM6直到細胞外側(cè)端，這些結(jié)構單元共同參與了整個變化過程。這一系列過程也首次指出了在輸出體蛋白中序列高度保守的X線團在傳導結(jié)構域構象變化方面的重要作用。對MsbA構象變化過程的研究證實了長期以來人們關于ABC轉(zhuǎn)運體蛋白轉(zhuǎn)運機理的一個假設，即蛋白質(zhì)的大范圍構象變化是由核苷結(jié)合結(jié)構域的構象變化引發(fā)的，而構象變化信號在結(jié)構域之間的傳遞呈現(xiàn)出清晰的時間空間順序。
　　與ABC轉(zhuǎn)運體蛋

13、白相比，PSD-95蛋白的N端PDZ12串列體的結(jié)構較為簡單。它含有兩個球狀的PDZ結(jié)構域PDZ1和PDZ2，之間通過一段序列保守的五肽連接片段串列而成。兩個PDZ結(jié)構域都能夠特異性地與目標蛋白的C末端結(jié)合，作為信號傳導、膜受體集聚以及細胞極性維持等生理過程中的重要一環(huán)。實驗發(fā)現(xiàn)，在未結(jié)合肽段時，PDZ12串列體的兩個PDZ結(jié)構域之間的取向相對固定，而在結(jié)合肽段之后則不再具有這種固定取向。這預示著PDZ12串列體在結(jié)合肽段后發(fā)生了大幅度

14、的構象變化。我們利用分子動力學模擬直接比較了無肽段結(jié)合狀態(tài)和肽段結(jié)合狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12納秒的模擬很好地表現(xiàn)出肽段結(jié)合對PDZ1和PDZ2結(jié)構域之間相對運動的影響。無底物結(jié)合態(tài)PDZ12的PDZ結(jié)構域相對取向夾角的取值范圍較小，約有50°，相比之下，肽段結(jié)合后夾角的擺動幅度可以達到150°。也就是說，肽段的結(jié)合加大了PDZ結(jié)構域相對取向的運動自由度。從能量變化的角度來講，自由肽段與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合會降低肽段的自由度，從而降低整個過程的熵變

15、不利于反應的進行。PDZ12串列體則顯示其兩個PDZ結(jié)構域和五肽連接片段之間存在著一套聯(lián)動機制，這使它能夠在肽段結(jié)合后通過提高結(jié)構域間相對運動的自由度來彌補肽段結(jié)合帶來的熵損失，更利于蛋白與肽段的結(jié)合。通過結(jié)構域之間的相對運動來調(diào)控蛋白和配體的相互作用強度是一種全新的蛋白質(zhì)動力學與功能關系的模式，我們預計這一調(diào)控方式具有在多結(jié)構域模塊的支架蛋白中普遍存在。
　　介導膜融合的SNARE蛋白Ykt6的結(jié)構更為簡單，由一個球狀的long

16、in結(jié)構域和一段60個氨基酸殘基左右的SNARE核心區(qū)兩部分組成，但它在生理過程中依然會發(fā)生復雜的構象變化。其結(jié)構中，SNARE核心區(qū)在囊泡運輸過程囊泡與目標膜層的對接和融合中起著核心作用，而longin結(jié)構域則有著調(diào)控SNARE核心區(qū)構象的功能。實驗發(fā)現(xiàn)，在體系中加入DPC脂質(zhì)分子會使得YKt6蛋白整體處于關閉構象，類似生理狀態(tài)下法尼酰化Ykt6蛋白的自抑制狀態(tài)。這時，SNARE核心區(qū)包裹在longin結(jié)構域外側(cè)，在longin結(jié)構域

17、和SNARE核心區(qū)的界面上形成疏水槽用以容納脂質(zhì)分子疏水側(cè)鏈。而當體系中沒有脂質(zhì)分子時，Ykt6蛋白則呈現(xiàn)出比較廣泛的運動范圍，在多個構象之間運動切換。通過對含DPC分子的體系(DPC-Ykt6)，無底物結(jié)合態(tài)體系(apo-Ykt6)和法尼酰化體系(far-Ykt6)各50納秒的模擬，我們發(fā)現(xiàn)DPC分子能夠用其親水端和疏水端同時與Ykt6蛋白作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的結(jié)構并使之只在局部構象空間中運動。相比之下，apo-Ykt6體系由于沒

18、有疏水鏈的存在疏水槽發(fā)生坍縮形變，整個蛋白的構象分布也更廣，表現(xiàn)出與實驗結(jié)果相似的多構象切換特點。far-Ykt6體系則保持了DPC-Ykt6體系主要的結(jié)構特點，在構象空間上顯示出與DPC-Ykt6體系相似的集中分布，說明體系在50納秒的分子動力學模擬后已經(jīng)達到收斂。蛋白質(zhì)分子處在穩(wěn)定的構象狀態(tài)并與apo-Ykt6體系存在構象重疊。我們的結(jié)果解釋了DPC分子對Ykt6蛋白構象的穩(wěn)定機制，同時也證明了DPC-Ykt6結(jié)構能夠很好地代表法尼

19、?；痀kt6蛋白的結(jié)構。以往人們公認脂質(zhì)化修飾的功能是幫助蛋白在膜上定位，而脂質(zhì)化修飾主動調(diào)節(jié)蛋白構象變化則是一種全新的功能模式。我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)化修飾對Ykt6構象變化的調(diào)控符合蛋白質(zhì)構象調(diào)控中的“構象選擇”模型，即蛋白質(zhì)自身“預先”存在多個構象，構象的調(diào)控是通過與其他蛋白或配體相互作用，移動構象分布平衡來實現(xiàn)的。
　　我們的工作表明蛋白質(zhì)分子的構象柔性和動力學性質(zhì)具有重要的功能意義，長期進化的結(jié)果使蛋白質(zhì)具有高度精密的整體協(xié)調(diào)性來

20、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的大幅度構象變化，并且這種調(diào)節(jié)模式具有多樣性的特點。BtuCD和MsbA轉(zhuǎn)運體蛋自能夠協(xié)調(diào)自身各結(jié)構單元，通過核苷結(jié)合結(jié)構域與跨膜結(jié)構域的耦合機制進行底物分子的運輸。PDZ12串列體能夠協(xié)調(diào)肽段結(jié)合位點和五肽連接片段的動態(tài)運動性質(zhì)，通過提高PDZ結(jié)構域之間的相對運動自由度彌補結(jié)合肽段造成的熵損失。Ykt6蛋白則能夠?qū)χ|(zhì)長鏈進行響應，調(diào)控自身在構象空間上的分布。此外，我們的工作也表明分子動力學模擬是研究蛋白質(zhì)分子大幅度構象