1、第一部分 TWIST誘導(dǎo)下咽癌FaDu細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?一方面探討TWIST的表達(dá)變化對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其促進(jìn)下咽癌FaDu細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制;另一方面探討TWIST在下咽癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理資料的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法:體外實(shí)驗(yàn)部分，實(shí)驗(yàn)分組為T(mén)WIST過(guò)表達(dá)載體組(pcDNA3.1-TWIST)及其對(duì)照組，TWIST沉默載體組(Mic

2、roRNA-TWIST)及其對(duì)照組，利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞，并利用Western blot的方法，驗(yàn)證TWIST蛋白在上述兩種載體及對(duì)照組中的表達(dá)情況;利用倒置相差顯微鏡，觀(guān)察TWIST過(guò)表達(dá)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞形態(tài)的影響;利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察TWIST過(guò)表達(dá)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響;Western blot檢測(cè)TWIST過(guò)表達(dá)和沉默時(shí)分別對(duì)E-cadherin和N-cadherin表

3、達(dá)的影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，采用免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)TWIST在下咽癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理資料（年齡，性別，腫瘤的大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示:TWIST在pcDNA3.1-TWIST組中較對(duì)照組表達(dá)升高，在miR-TWIST組中較對(duì)照組表達(dá)降低;倒置顯微鏡觀(guān)察Fadu細(xì)胞的形態(tài)改變，結(jié)果顯示:在pcDNA3.1-TWIST組中，細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)條梭

4、形，細(xì)胞處于松散狀，細(xì)胞間的極性丟失，細(xì)胞間的粘附性降低;TranswellTM小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遷移實(shí)驗(yàn)中，pcDNA3.1-TWIST組的細(xì)胞遷移數(shù)是對(duì)照組的1.8倍(P＜0.05)，表明TWIST過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)Fadu細(xì)胞遷移能力;侵襲實(shí)驗(yàn)中，pcDNA3.1-TWIST組中，細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)是對(duì)照組的1.6倍(P＜0.05)，表明TWIST過(guò)表達(dá)同樣能增強(qiáng)Fadu細(xì)胞侵襲能力。檢測(cè)TWIST變化對(duì)E-cadherin和N-cadherin的

5、影響，Western blot結(jié)果顯示:在pcDNA3.1-TWIST組中，TWIST表達(dá)升高時(shí)，E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin升高;在miR-TWIST組表達(dá)，TWIST表達(dá)降低時(shí)，E-cadherin升高，N-cadherin表達(dá)降低，表明TWIST促進(jìn)Fadu細(xì)胞發(fā)生了EMT。利用免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)下咽癌組織和癌旁組織中TWIST的表達(dá)，結(jié)果顯示:TWIST在下咽癌組織中有表達(dá)，癌旁組織中未見(jiàn)表達(dá)。TWI

6、ST在下咽癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，但細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)更明顯;研究TWIST表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系，結(jié)果顯示:TWIST表達(dá)與下咽癌的分化(P=0.038)，腫瘤大小(P=0.048)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.044)有關(guān);而TWIST表達(dá)與病人性別、年齡無(wú)關(guān)(P＞0.050)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)了TWIST在pcDNA3.1-TWIST組中較對(duì)照組表達(dá)升高，在miR-TWIST組中較對(duì)照組表達(dá)降低，表明TW

7、IST過(guò)表達(dá)載體和沉默載體構(gòu)建成功并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，其作為后續(xù)的基礎(chǔ)。TWIST的過(guò)表達(dá)能影響Fadu細(xì)胞的形態(tài)改變，并促進(jìn)Fadu細(xì)胞的遷移和侵襲能力;TWIST變化導(dǎo)致E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)變化，表明TWIST誘導(dǎo)Fadu細(xì)胞發(fā)生EMT;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，研究發(fā)現(xiàn)TWIST在下咽癌組織中表達(dá)，且其表達(dá)與下咽癌組織的分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別無(wú)關(guān)。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TWIST的表達(dá)與下咽癌組

8、織的分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且能促進(jìn)下咽癌Fadu細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制，是TWIST通過(guò)促進(jìn)下咽癌發(fā)生EMT和調(diào)控E-cadherin和N-cadherin表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 TNFα通過(guò)NF-κB通路調(diào)控TWIST表達(dá)誘導(dǎo)下咽癌Fadu細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，TNFα能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與EMT的發(fā)生有

9、關(guān)。但是具體的機(jī)制并不清楚，所以，本實(shí)驗(yàn)研究意在探討TNFα對(duì)下咽癌細(xì)胞Fadu發(fā)生EMT及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并深入闡釋其內(nèi)在可能的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:以下咽癌Fadu細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料， TNFα(10 ng/ml)處理組為實(shí)驗(yàn)組，TNFα(10 ng/ml)未處理組為對(duì)照組。TNFα(10 ng/ml)作用Fadu細(xì)胞24 h，利用細(xì)胞劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同組細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，觀(guān)察TNFα(10 ng/ml)對(duì)FaDu細(xì)胞的運(yùn)

10、動(dòng)能力的影響;采用Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀(guān)察TNFα(10 ng/ml)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;利用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，探討TNFα(10 ng/ml)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞形態(tài)的影響;利用細(xì)胞免疫熒光染色及共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)不同組中上皮間充質(zhì)標(biāo)志物E-cadherin，N-cadherin表達(dá)，觀(guān)察TNFα(10 ng/ml)對(duì)E-cadherin，N-cadherin表

11、達(dá)的影響;為了進(jìn)一步明確TNFα(10 ng/ml)對(duì)E-cadherin，Vimentin的影響，采用Western blot檢測(cè)TNFα(10g/ml)處理FaDu細(xì)胞不同時(shí)間(0h，1h，3h，5h)時(shí)E-cadherin，Vimentin的表達(dá);為了進(jìn)一步探討TNFα(10 ng/ml)對(duì)E-cadherin，Vimentin影響的機(jī)制，采用了Western blot和免疫熒光染色及共聚焦熒光顯微鏡，檢測(cè)TNF(10 ng/ml

12、)處理FaDu細(xì)胞不同時(shí)間(0h，1h，3h，5h)時(shí)TWIST，p65的表達(dá)變化;為了研究TNFα對(duì)p65的影響，同時(shí)檢測(cè)TNFα(10ng/ml)處理FaDu細(xì)胞不同時(shí)間(0h，1h，3h，5 h)時(shí)p-Ikk及p-Iκ Bα表達(dá)變化;為了研究p65對(duì)TWIST的影響，利用NF-κB特異性抑制劑(BAY11-7082)和siRNA-p65質(zhì)粒，降低p65表達(dá)，同時(shí)利用Western blot檢測(cè)各組中TWIST的表達(dá)變化。
　

13、　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:TNFα作用細(xì)胞24 h后，TNFα處理組中，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度比對(duì)照組明顯加快;遷移實(shí)驗(yàn)中，處理組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)分別是276±38，124±15，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)中，TNFα處理組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)分別是95±3，63±6，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;TNFα(10 ng/ml)作用后，F(xiàn)adu細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，TNFα處理組的細(xì)胞極性丟失，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，分散狀，細(xì)胞間的粘附性降低等間充質(zhì)細(xì)

14、胞表型，而對(duì)照組細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞間的粘附性高。此外，免疫熒光及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNFα處理組中，上皮標(biāo)志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高;TNFα(10 ng/ml)作用Fadu細(xì)胞不同時(shí)間(0h，1h，3h，5h)后，利用Western blot檢測(cè)作用不同時(shí)間的TWIST表達(dá)，結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TWIST的表達(dá)升高;TNFα(10 ng

15、/ml)作用Fadu細(xì)胞不同時(shí)間(0h，1h，3h，5h)后，利用Western blot檢測(cè)作用不同時(shí)間的p65，p-Ikk和p-IκBα的表達(dá)，結(jié)果顯示:隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)均升高;免疫熒光和Western blot檢測(cè)p65和TWIST表達(dá)，結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組核內(nèi)p65和TWIST表達(dá)升高;利用siRNA-p65和BAY11-7082降低p65表達(dá)，Western blot檢測(cè)p65和TWIST表達(dá)，結(jié)果顯示:s

16、iRNA-p65和BAY11-7082均能降低p65表達(dá)，p65降低的同時(shí)TWIST表達(dá)降低。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:TNFα能夠促進(jìn)FaDu細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，遷移及浸潤(rùn)能力;TNFα能誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞形態(tài)由細(xì)胞間排列緊密、橢圓形，極性存在的上皮樣表型，向細(xì)胞松散、呈梭形、極性丟失的間充質(zhì)表型變化，同時(shí)伴有上皮標(biāo)志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高，表明TNFα誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞發(fā)生具有較強(qiáng)遷移及