1、第一部分:
　　 前言：DICER屬于RNaseⅢ(雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶)家族成員，由DICER基因編碼。DICER蛋白是一種約210kD的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，包含四個ORF框架：DExH/DEAH解旋酶、PAZ、兩個RNaseⅢ催化區(qū)、與雙鏈RNA結(jié)合區(qū)DS-RBD。人類的DICER基因定位于14q32.2，在各種組織中廣泛表達(dá)。DICER在RNAi過程中對于siRNA和miRNA的產(chǎn)生起著重要的作用。DICER能特異性地將

2、長的雙鏈RNA剪切為21～23nt5’磷酸化、3’端有2～3個核苷酸懸端的siRNA，以復(fù)合物的形式作用于微小RNA(microRNA，miRNA)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的產(chǎn)生，后者特異性結(jié)合靶基因mRNA，引起轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄水平后水平或翻譯水平的基因沉默，調(diào)控目的基因的表達(dá)。
　　 RNA干擾(RNA Interference，RNAi)是雙鏈RNA引起的同源mRNA特異性降解

3、的現(xiàn)象。RNAi干擾現(xiàn)象廣泛存在于生物界中。有多種酶和蛋白參與RNAi的過程。DICER蛋白能夠促使miRNA和siRNA成熟，是RNAi機制和miRNA信號通路中的一種關(guān)鍵酶。目前，對DICER的認(rèn)識主要局限于其對頸環(huán)或雙鏈RNA的剪切功能。已有研究表明，DICER與動物生殖發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而與此相關(guān)的DICER凋控的分子機理尚不明確。因此，對DICER基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究具有重要的理論意義。
　　 本研究利用

4、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，探討了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對DICER轉(zhuǎn)錄水平及其下游信號的調(diào)控作用，證明NF-κB/p65同源二聚體通過與DICER啟動子的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控DICER蛋白的表達(dá)，從而引起下游miRNA表達(dá)水平的改變。對于DICER條件敲除小鼠的進(jìn)一步的研究表明，p65/DICER/miRNA信號通路是機體內(nèi)存在的一種微調(diào)機制，對于維持機體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)平衡起到重要的作用。這條信號通路對于生物體內(nèi)由于LPS刺激所引起的

5、TNF-α的產(chǎn)生起到重要的調(diào)控作用。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、人胚腎細(xì)胞系HEK293、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7
　　 2、Real-time RT-PCR實驗相關(guān)試劑
　　 3、Western印跡雜交相關(guān)試劑
　　 4、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑
　　 5、電泳泳動遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相

6、關(guān)試劑
　　 6、Elisa檢測相關(guān)試劑
　　 7、DICER轉(zhuǎn)基因小鼠、Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠
　　 一、實驗方法
　　 1、應(yīng)用軟件分析DICER啟動子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系列截短的DICER啟動子螢光素酶報告基因載體，應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析各段啟動子的活性。
　　 2、應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析NF-κB激活劑和抑制劑刺激前后DICER啟動子及其突變體的活性變化。
　　 3、應(yīng)用螢光素酶檢測

7、系統(tǒng)分析NF-κB p65及p50亞基對DICER啟動了的活性影響。
　　 4、EMSA方法體外鑒定DICER啟動子區(qū)對NF-κB元件結(jié)合力的影響；ChIP實驗進(jìn)一步在體內(nèi)條件下驗證NF-κB特異性亞基與該位點的結(jié)合。
　　 5、Real-time RT-PCR方法檢測NF-κB p65及p50亞基對DICER mRNA表達(dá)水平的作用。
　　 6、Western印跡雜交檢測NF-κB p65及p50亞基對DICE

8、R蛋白表達(dá)水平的作用。
　　 7、Real-time RT-PCR方法檢測DICER下游microRNA表達(dá)水平的變化。
　　 8、RT-PCR和ELISA檢測p65/DICER信號通路對TNF-α表達(dá)水平的調(diào)控。
　　 9、構(gòu)建肝細(xì)胞DICER特異性敲除的小鼠。
　　 10、構(gòu)建急性肝損傷小鼠模型，Western印跡雜交檢測DICER蛋白表達(dá)水平。
　　 11、ELISA檢測肝細(xì)胞特異性敲除DI

9、CER的小鼠中TNF-α表達(dá)水平的調(diào)控。
　　 結(jié)果：
　　 1、軟件分析預(yù)測DICER啟動子的位置及其中存在的潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；螢光素酶報告基因證實DICER的啟動子區(qū)(-440～-195)以及NF-κB/p65亞基對DICER啟動子活性的影響。
　　 2、EMSA和ChIP實驗分別在體外和體內(nèi)條件下證明了DICER啟動子區(qū)(-208～-199)為NF-κB/p65反應(yīng)元件。
　　 3、Real-

10、time RT-PCR和Western印跡雜交證明NF-κB/p65及其激活劑LPS影響DICER mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 4、Real-time RT-PCR結(jié)果證明NF-κB/p65對DICER的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響其下游miRNA的表達(dá)。
　　 5、RT-PCR和ELISA結(jié)果證明p65/DICER信號通路調(diào)控TNF-α的表達(dá)水平。
　　 6、肝細(xì)胞特異性敲除DICER的小鼠構(gòu)建成功。
　　 7、

11、急性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功，Western印跡雜交的結(jié)果證明DICER蛋白表達(dá)水平增高。
　　 8、ELISA結(jié)果證明肝細(xì)胞特異性敲除DICER的小鼠中TNF-α表達(dá)水平遠(yuǎn)高于對照小鼠。
　　 結(jié)論
　　 1、DICER啟動子區(qū)位于5’側(cè)翼區(qū)(-440～-195)，-208～-199區(qū)為NF-κB/p65亞基的反應(yīng)元件。
　　 2、NF-κB/p65同源二聚體通過與DICER啟動子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控D

12、ICER蛋白的表達(dá)，從而引起下游miRNA表達(dá)水平的改變。
　　 3、p65/DICER信號通路對于生物體內(nèi)由于LPS刺激所引起的TNF-α的產(chǎn)生起到重要的調(diào)控作用。
　　 第二部分：
　　 前言：
　　 卵巢癌在西方國家中是女性惡性腫瘤致死的主要原因。根據(jù)美國國家癌癥中心2009年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2009年美國國內(nèi)新增21550例卵巢癌患者，有14600名患者死于卵巢癌。令人遺憾的是，卵巢癌在發(fā)病早期的放化

13、療治療過程后，臨床表現(xiàn)為容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。因此，了解卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制可以為卵巢癌的治療提供依據(jù)。
　　 microRNA(miRNA)是一類長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，約21～23nt，大多數(shù)的miRNA通過在翻譯水平上介導(dǎo)其靶mRNA的降解或切割，對目的基因進(jìn)行調(diào)控。成熟的miRNA通過與其目標(biāo)mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3'UTR)互補匹配使得靶基因mRNA的翻譯

14、受到抑制。最近的研究表明，miRNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化。此外，有研究表明，miRNA水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生顯著相關(guān)，提示miRNA和癌癥之間可能有潛在的關(guān)聯(lián)。而且，在臨床標(biāo)本的收集過程中，miRNA因為易于保持完整性，在對正常組織和癌癥組織的判定上優(yōu)于mRNA。
　　 已有研究表明，在基因組的miRNA表達(dá)圖譜中，miR-125b在人類的卵

15、巢癌中出現(xiàn)異常表達(dá)。然而，miR-125b在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b的過表達(dá)可以抑制人類卵巢癌細(xì)胞系的增殖以及裸鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的生長。miR-125b促使卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞周期出現(xiàn)G2期阻滯。miR-125b在翻譯水平上，抑制前癌基因BCL-3的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。我們的研究表明異常的miR-125b表達(dá)對人類卵巢癌的發(fā)生發(fā)展起到重要的作用。
　　 材料與方法：

16、r>　　 一、實驗材料
　　 1、人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和ES2
　　 2、臨床卵巢癌患者及正常對照標(biāo)本
　　 3、Real-time RT-PCR實驗相關(guān)試劑
　　 4、基因克隆，點突變及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑
　　 5、細(xì)胞增殖實驗相關(guān)試劑
　　 6、細(xì)胞周期實驗相關(guān)試劑
　　 7、Western印跡雜交相關(guān)試劑
　　 8、體外成瘤實驗相關(guān)試劑，裸鼠
　

17、　 二、實驗方法
　　 1、Real-time RT-PCR方法檢測臨床標(biāo)本中miR-125b的表達(dá)水平。
　　 2、細(xì)胞生長曲線和克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖。
　　 3、細(xì)胞周期分析miR-125b過表達(dá)的SKOV3穩(wěn)定株細(xì)胞系。
　　 4、應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析BCL-3的3’-UTR是miR-125b的一個靶點。
　　 5、Western印跡雜交檢測miR-125b對內(nèi)源BCL-3表達(dá)的影

18、響。
　　 6、體內(nèi)成瘤實驗檢測miR-125b對體內(nèi)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、Real-time RT-PCR結(jié)果證明在39例卵巢癌臨床標(biāo)本(28例癌組織、11例正常組織)中，癌組織中的miR-125b的表達(dá)水平明顯低于正常組織。
　　 2、細(xì)胞生長曲線繪制和克隆形成結(jié)果證明，在miR-125b高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞中，細(xì)胞增殖和克隆的形成與對照組細(xì)胞相比明顯降低；與之相反，在miR-

19、125b低表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞，細(xì)胞增殖與對照組細(xì)胞相比明顯增加。
　　 3、流式細(xì)胞分析和Western印跡雜交結(jié)果顯示miR-125b過表達(dá)的SKOV3穩(wěn)定株細(xì)胞系與對照組細(xì)胞相比，細(xì)胞周期出現(xiàn)G2期阻滯。
　　 4、螢光素報告基因檢測結(jié)果證明，BCL-33’-UTR是miR-125b的靶點。
　　 5、Real-time RT-PCR和Western印跡雜交結(jié)果顯示miR-125b是在翻譯水平上抑制BCL-3的

20、表達(dá)。
　　 6、體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果證明在體內(nèi)環(huán)境下，高表達(dá)的miR-125b可以抑制卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，而低表達(dá)的miR-125b促進(jìn)腫瘤的生成。
　　 結(jié)論
　　 1、miR-125b在人類卵巢癌中表達(dá)水平降低。
　　 2、過表達(dá)的miR-125b會導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，降低細(xì)胞增殖和克隆形成能力以及在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。
　　 3、BCL-3是miR-125b在卵巢癌中的靶基因。<