1、目的：
　　肝細(xì)胞肝癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。在中國，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率正在上升，目前占世界肝細(xì)胞肝癌總數(shù)的55％，這給人民身體素質(zhì)的提升及國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondrial DNA)突變和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphis ms)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。不同于核DNA（nuclear DNA），線粒

2、體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）由于缺乏組蛋白保護(hù)、它的修復(fù)能力差以及處于富含活性氧（ROS）環(huán)境中，所以容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，因而容易發(fā)生基因改變。在我們實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)線粒體D-loop區(qū)基因的多態(tài)性和肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。線粒體基因的D-loop區(qū)通過影響線粒體基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制從而改變線粒體基因，然而線粒體編碼區(qū)的基因幾乎不含內(nèi)含子，所以線粒體編碼區(qū)基因單核苷酸多態(tài)性可以通過改變

3、編碼的氨基酸類型改變氧化磷酸化的功能從而影響線粒體功能。線粒體編碼區(qū)基因與肝細(xì)胞肝癌的相關(guān)性很少有人研究，所以開展線粒體編碼區(qū)基因與肝細(xì)胞肝癌的相關(guān)性研究具有重要的意義。本研究通過對ND基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對從而找出多態(tài)性基因位點(diǎn)，利用病例-對照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析多態(tài)性基因位點(diǎn)與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，這為HCC易患人群早期篩查及防治工作提供新思路。
　　方法：
　　1.研究對象及標(biāo)本采集：病例組的80例肝細(xì)胞肝

4、癌患者為2007年9月至2008年3月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科住院病人，這些病人術(shù)前經(jīng)免疫學(xué)檢查和影像學(xué)方法臨床診斷為肝細(xì)胞肝癌，并且這些病人術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌。對照組是2008年10月至2009年4月期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院采集的正常人抗凝靜脈血標(biāo)本。
　　2.基因組DNA提?。悍蛛x提取肝細(xì)胞肝癌組病人血樣及對照組血樣基因組DNA，提取基因組DNA后將其置于4℃的恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　3.PCR擴(kuò)增ND

5、基因：從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找ND基因，ND基因包含七個(gè)基因片段，即ND1、ND2、ND3、 ND4L、ND4、ND5和ND6，將ND基因按大約600bps的長度劃分為13段小的基因片段，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則為每段小基因片段設(shè)計(jì)PCR上游及下游引物，然后用PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，再放入凝膠成像系統(tǒng)中（美國Image公司）證實(shí)擴(kuò)增出DNA條帶，最后把擴(kuò)增的產(chǎn)物送至生工生物工程技術(shù)有限公司（Shanghai）

6、進(jìn)行測序。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法比較計(jì)數(shù)資料，并計(jì)算P值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05時(shí)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.肝細(xì)胞肝癌組和對照組臨床資料對比：兩組間性別、年齡無明顯差異(P>0.05)。
　　2.從肝細(xì)胞肝癌組中隨機(jī)的選出30例標(biāo)本DNA進(jìn)行擴(kuò)增測序，分析后發(fā)現(xiàn)4820G/A(P=0.237)

7、,4824A/G(P=0.112),5301A/G(P=0.237)的SNP分布頻率與對照組相比在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中具有潛在意義。
　　3.對4820G/A,4824A/G,5301A/G所屬基因片段的病例數(shù)量進(jìn)行擴(kuò)大（80例），發(fā)現(xiàn)5301A/G位點(diǎn)的SNP在病例組與對照組間的分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.783，P=0.029）。ND2基因的5301A/G位點(diǎn)SNP可導(dǎo)致ND2編碼蛋白的第278位氨基酸ILE（異亮氨酸）

8、轉(zhuǎn)換為LEU（亮氨酸），這可能影響ND2編碼蛋白的功能進(jìn)而影響整個(gè)呼吸鏈的功能，最終增加肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　4.將5301A/G位點(diǎn)SNP分布與肝細(xì)胞肝癌患者的臨床特征進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，5301A/G位點(diǎn)SNP和肝細(xì)胞肝癌患者的臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤長徑、Child分級、臨床分期及門脈瘤栓等都無相關(guān)性（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.mtDNA編碼區(qū)ND基因上的5301A/G位點(diǎn)S