1、目的:乳腺癌是影響女性健康最為常見的惡性腫瘤，亦是女性死亡的重要因素之一。乳腺癌是一種多基因、多因素、多階段積累的過程，且呈現(xiàn)明顯的家族聚集性，其中基因改變被認為是乳腺癌發(fā)生的基礎(chǔ)。由于線粒體基因(mitochondrial DNA，mtDNA)缺乏保護性組蛋白、修復(fù)能力的局限及處于高濃度氧自由基環(huán)境等因素，使其更易受到氧自由基的攻擊，從而更易產(chǎn)生基因損傷。目前多種實驗研究表明mtDNA的損傷可能參與了機體的致癌過程，其突變可能為誘導(dǎo)核

2、基因變異的內(nèi)源性原因之一，對腫瘤的產(chǎn)生具有一定的促進作用。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms，SNPs)是指基因組水平上由于單個核苷酸的變異引起的DNA的多態(tài)性轉(zhuǎn)變，在人類基因組中廣泛存在，決定著個體間基因序列的微小差異，可較好地反應(yīng)個體間的遺傳特點。近年來，線粒體DNA的變異已在多種實體瘤中被發(fā)現(xiàn)，且變異區(qū)域多位于D-Loop區(qū)，但關(guān)于D-Loop區(qū)SNPs與家族性乳腺癌的相關(guān)研究甚少。本研究

3、首次進行河北省家族性乳腺癌患者D-Loop區(qū)SNPs的相關(guān)研究及其與發(fā)病年齡的關(guān)系，進而研究腫瘤患者體細胞中mtDNA的序列及表達調(diào)控，探討mtDNA突變及SNPs與家族性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險及發(fā)病年齡的關(guān)系，為乳腺癌的基因診斷及個體化治療提供新思路。
　　方法:
　　1研究對象:選取2008年1月-2013年5月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心就診的家族性乳腺癌患者60例，散發(fā)性乳腺癌患者92例，均經(jīng)組織病理學(xué)確診為乳腺癌。選取家

4、族性乳腺癌家系中健康一級女性親屬41例，于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢中心體檢的正常女性93例作為對照組，并除外與乳腺癌相關(guān)的疾病。在獲取知情同意后，采集外周靜脈血標本3ml，并準確記錄各實驗組樣本信息。以上樣本的采集均通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會審批。
　　2線粒體DNA提取、擴增及測序:采用DNA純化試劑盒提取各實驗組靜脈血標本的線粒體DNA，DNA經(jīng)定量鑒定合格后，采用PCR技術(shù)擴增目的片段，上游引物為:5'-CCCCAT

5、GCTTACAAGCAAGT-3'，下游引物為:5'-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3'。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實后進行DNA測序，測序反應(yīng)采用ABI PRISM(R) BigDyeTerminator v3.1循環(huán)測序反應(yīng)試劑盒，所用儀器為ABI PRISM(R)3730XL測序儀。各標本均采用雙向重復(fù)測序。
　　3統(tǒng)計分析:采用x2檢驗比較家族性乳腺癌及散發(fā)性乳腺癌患者的臨床特征及各實驗組的D-Loop區(qū)

6、多態(tài)位點變異情況，單因素分析采用Kaplan-Meier方法及Log-Rank方法，實驗數(shù)據(jù)均選用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　160例家族性乳腺癌患者與92例散發(fā)性乳腺癌患者臨床資料對比分析:病理類型分布在兩組間存在顯著性差異(P=0.020)，發(fā)病年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、絕經(jīng)情況、HER-2表達及ER/PR表達情況均無顯著性差異（P＞0.05）。

7、　　2參照劍橋序列，在全長為982bp的測序序列中，共發(fā)現(xiàn)101個多態(tài)性變異位點，變異率為10.3％。散發(fā)性乳腺癌患者(P=0.002)、家族性乳腺癌患者(P=0.004)及其一級親屬(P=0.010)的多態(tài)性位點分布頻次較正常對照組均具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3將各實驗組D-Loop區(qū)的SNPs分布頻率進行比較分析。其中散發(fā)性乳腺癌患者與正常對照組對比，315C/Cinsert，524C/del，16247A/del，16248C/

8、del,16249T/C,16257C/A,16258A/del,16259C/del,16262C/del,16268C/del，16279C/del，16280A/del，16297T/C及16300A/del位點均有顯著性差異，可能為散發(fā)性乳腺癌相關(guān)多態(tài)位點。以上位點同樣被認定為家族性乳腺癌相關(guān)多態(tài)位點。
　　4在310(P=0.025)，16319(P=0.011)及16362(P=0.026)位點只有家族性乳腺癌患者與正

9、常對照組進行對比存在顯著性差異。其中，16319位點的變異可能增加了乳腺癌高發(fā)家族成員的發(fā)病風(fēng)險，反之，310及16362位點的基因型改變可能降低了其發(fā)病風(fēng)險。
　　516247位點為乳腺癌相關(guān)多態(tài)位點，在家族性乳腺癌患者中較散發(fā)性乳腺癌患者變異率高(P=0.035)。
　　6489T/C只有在家族性乳腺癌患者及其一級親屬進行對比的過程中出現(xiàn)顯著性差異(P=0.020)。
　　7將家族性乳腺癌患者發(fā)病相關(guān)的D-Loop

10、區(qū)多態(tài)位點與患者發(fā)病年齡進行分析，結(jié)果顯示16311C基因型患者的發(fā)病年齡較16311T基因型患者的發(fā)病年齡顯著性降低(P=0.022)。
　　結(jié)論:
　　1家族性乳腺癌患者患非浸潤性導(dǎo)管癌的幾率較散發(fā)性乳腺癌患者高，包括侵襲力較強的髓樣癌，可能是家族性乳腺癌患者惡性程度較高的原因之一。
　　2乳腺癌mtDNA的D-Loop區(qū)是一具有高度多態(tài)性的區(qū)域，多態(tài)性以單堿基置換和缺失為主，主要分布于第Ⅰ高變區(qū)(HVR1)和第Ⅱ

11、高變區(qū)(HVR2)，可能與細胞惡變及乳腺癌的易感性有關(guān)。
　　3 mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，其中310，16319及16362位點可能為家族性乳腺癌特異性腫瘤相關(guān)位點，其中，16319位點的變異可能增加了乳腺癌高發(fā)家族成員的發(fā)病風(fēng)險，反之，310及16362位點的基因型改變可能降低了其發(fā)病風(fēng)險。
　　416247位點在家族性乳腺癌患者中較散發(fā)性乳腺癌患者變異率高，可能表明該位點高變異家族患乳腺