1、目的：探索TIMELESS在宮頸癌中的表達(dá)及其功能，靶向TIMELESS對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、克隆、順鉑敏感性的影響。
　　方法：生物信息學(xué)分析 TIMELESS在三個(gè)獨(dú)立的宮頸癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)；通過(guò)對(duì)子宮頸上皮內(nèi)瘤變（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）和宮頸癌組織進(jìn)行免疫組化研究，分別檢測(cè)TIMELESS在CIN I、CIN II、CIN III和宮頸癌組織中的表達(dá)；利

2、用宮頸癌組織芯片進(jìn)行免疫組化分析，研究 TIMELESS在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率；用Western Blot技術(shù)分析人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A細(xì)胞中TIMELESS的表達(dá)，篩選高表達(dá)細(xì)胞株；設(shè)計(jì)合成三組針對(duì)人TIMELESS基因的小干擾RNA(siRNA)，并通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞株體內(nèi)，應(yīng)用 Western blot技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（TIMELESS siRNA＃

3、1組、siRNA#2組和siRNA#3組）及陰性對(duì)照 siRNA(Ctrl siRNA組)TIMELESS mRNA和蛋白的表達(dá)；CCK8法檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖能力以及對(duì)順鉑敏感性的變化；通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組在凋亡中的差異；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的克隆形成能力；細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TIMELESS siRNA并聯(lián)合順鉑處理，β-半乳糖苷酶法檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老；通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved caspas

4、e-3各組細(xì)胞的表達(dá)；通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)TIMELESS敲除后各組細(xì)胞γ-H2AX及Rad51蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示TIMELESS在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織（P<0.05）,提示 TIMELESS可能在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用；2.TIMELESS在從CIN I、CIN II、CIN III到宮頸癌的進(jìn)展過(guò)程中陽(yáng)性表達(dá)水平逐漸升高，呈明顯遞增趨勢(shì)(P<0.05）；3.

5、對(duì)宮頸癌的組織芯片進(jìn)行TIMELESS免疫組化分析，發(fā)現(xiàn) TIMELESS在宮頸癌中有52.5％(21/40例)呈陽(yáng)性表達(dá)；4.宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A細(xì)胞中TIMELESS蛋白表達(dá)水平中，SiHa細(xì)胞中TIMELESS蛋白表達(dá)較高；5.靶向TIMELESS的三對(duì)特異性siRNA：siRNA#1,siRNA#2,siRNA#3均可明顯抑制TIMELESS的表達(dá)，在SiHa細(xì)胞中，相對(duì)Ctrl siRNA組，R

6、TPCR結(jié)果顯示 siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3組中 TIMELESS的 mRNA表達(dá)量分別為（0.263±0.018）、（0.157±0.013）、（0.286±0.021），Western Blot結(jié)果顯示 siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3組中TIMELESS蛋白表達(dá)量分別為（0.162±0.052）、（0.134±0.057），（0.173±0.062）（P<0.01）。siRNA#1和siRNA#2

7、的效果較好。6.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示siRNA#1組與siRNA#2組細(xì)胞的增殖能力顯著下降；7.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組 siRNA#1組與 siRNA#2組的細(xì)胞早期凋亡明顯增加;8.在 Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中，SiHa細(xì)胞克隆數(shù)為（209.333±3.383），（111±3.786），（129.667±3.590）；9.β-半乳糖苷酶法檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老，順鉑作用后，顯示實(shí)驗(yàn)組的

8、衰老細(xì)胞比率均上升（P<0.0001）。10.隨著順鉑濃度的增加，Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖均受到抑制，細(xì)胞半數(shù)抑制率IC50（μg/ml）分別為7.907，5.052，2.565，可見TIMELESS siRNA可以增加宮頸癌SiHa細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性；11.實(shí)驗(yàn)組中，凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved caspase-3表達(dá)有明顯的增加；12. TIMELESS敲減后，DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H