1、本試驗(yàn)采用不同方法對(duì)犢牛睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，分析其最佳分離純化方法。通過(guò)凍存試驗(yàn)，觀察支持細(xì)胞凍存后恢復(fù)情況。檢測(cè)并比較支持細(xì)胞及其條件培養(yǎng)液對(duì)犢牛PBMC及小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。獲得如下結(jié)果： 1分別采用Ⅰ、Ⅳ型膠原酶與胰蛋白酶相結(jié)合對(duì)犢牛睪丸進(jìn)行次第消化，證明采用1g/L的Ⅳ型膠原酶消化10 min、2.5 g/L的胰蛋白酶消化8 min的消化方法消化犢牛支持細(xì)胞所用的時(shí)間最短，得到的細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞活力在95％

2、以上。 2犢牛睪丸支持細(xì)胞在培養(yǎng)3 h～4 h后開始貼壁，5 h換液，能夠去除大部分精原細(xì)胞，24 h后，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3 min～5 min的低滲處理，能夠去除殘存的精原細(xì)胞48 h后，細(xì)胞基本鋪成單層。分離得到的犢牛支持細(xì)胞經(jīng)過(guò)液氮凍存21 d后，取出培養(yǎng)，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)。 3犢牛睪丸支持細(xì)胞在培養(yǎng)3 d～4 d，相鄰細(xì)胞有緊密連接，細(xì)胞融合成片，鋪成膜狀單層

3、，胞質(zhì)中可見較多的顆粒狀物質(zhì)或空泡。經(jīng)過(guò)Feulgen染色后，可見細(xì)胞核內(nèi)的衛(wèi)星核小體，SABC免疫組化染色可見支持細(xì)胞胞漿及胞膜呈黃染，為FasL陽(yáng)性表達(dá)。 4犢牛睪丸支持細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞活性影響實(shí)驗(yàn)證明，支持細(xì)胞可顯著抑制犢牛和小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。同時(shí)證明，支持細(xì)胞可直接或通過(guò)旁分泌發(fā)揮上述作用。通過(guò)在兩種類型細(xì)胞間鋪瓊脂糖，建立了一種新的共培養(yǎng)方法。 通過(guò)本次試驗(yàn)，建立了一種簡(jiǎn)單、易行的犢牛Sertoli細(xì)胞分離培養(yǎng)