1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)具有發(fā)育為三個胚層并進(jìn)一步分化為各種不同類型細(xì)胞的潛能被稱為多能性。自我更新和多能性維持是胚胎干細(xì)胞的兩個基本特征。ESC的染色質(zhì)處于一種高度開放的狀態(tài),組蛋白的甲基化修飾在早期胚胎的發(fā)生過程中起著重要的作用。
　　 腺苷二醛(Adenosine dialdehyde,AdOx),抑制了甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中副產(chǎn)物水解酶的活性,從而導(dǎo)致副產(chǎn)物在細(xì)胞中的累積而間接抑制了甲基轉(zhuǎn)移

2、過程,是一種常用的甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。
　　 小鼠P19胚胎瘤細(xì)胞(P19 embryonal carcinoma cells)具有胚胎干細(xì)胞的許多特征,具有分化成多種細(xì)胞類型的潛能和較強(qiáng)的自我更新能力。P19細(xì)胞在全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA,簡稱RA)誘導(dǎo)下,可向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。是研究胚胎干細(xì)胞多能性維持及神經(jīng)分化機(jī)制的很好模型。
　　 本論文利用AdOx處理P19細(xì)胞,初

3、步探討了蛋白質(zhì)甲基化在P19細(xì)胞多能性維持中的作用以及在染色質(zhì)水平的調(diào)控機(jī)制。
　　 1.AdOx抑制P19細(xì)胞的神經(jīng)分化潛能
　　 P19細(xì)胞在RA誘導(dǎo)4天時,細(xì)胞聚集成團(tuán),在撤除RA4天后,出現(xiàn)神經(jīng)元樣的細(xì)胞。但是用20μM AdOx預(yù)處理1天的P19細(xì)胞,不能聚集成團(tuán),幾乎沒有神經(jīng)元樣的細(xì)胞出現(xiàn)。通過免疫熒光染色計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn),未經(jīng)AdOx處理的P19細(xì)胞中有75％的細(xì)胞表達(dá)TuJ1蛋白,但經(jīng)AdOx預(yù)處理過的P19細(xì)

4、胞中,僅有8％的細(xì)胞表達(dá)。Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),在RA誘導(dǎo)神經(jīng)分化的第8天,AdOx處理過的P19細(xì)胞中TuJ1蛋白的表達(dá)量也明顯低于未經(jīng)AdOx處理的P19細(xì)胞,并且,隨著AdOx濃度的增加,AdOx對TuJ1蛋白表達(dá)的抑制越強(qiáng)。
　　 Ngn1,Mash1和NeuroD是神經(jīng)分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,利用Real timeRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),AdOx明顯抑制了RA誘導(dǎo)神經(jīng)分化過程中ngn1,mash1和ne

5、urodmRNA的表達(dá)水平。Id1是一種與神經(jīng)分化過程相拮抗的轉(zhuǎn)錄因子,AdOx在一定程度上促進(jìn)了id1 mRNA的表達(dá)。
　　 2.AdOx影響了P19細(xì)胞自我更新和多能性的維持
　　 P19細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和多能性維持能力。我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了AdOx對P19細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AdOx嚴(yán)重引起了P19細(xì)胞周期阻滯,即使在1μM AdOx處理時就能引起明顯的細(xì)胞周期阻滯,1μM,5μM和10μM Ad

6、Ox主要引起S期阻滯,20μM AdOx主要引起G2/M期阻滯。AdOx引起的P19細(xì)胞周期的阻滯,嚴(yán)重影響了P19細(xì)胞的自我更新能力。另外,較高濃度的AdOx也能引起HEK-293A和Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯。
　　 Real time RT-PCR結(jié)果顯示,AdOx促進(jìn)了P19細(xì)胞中多能性相關(guān)基因nanog,sox2和fgf4 mRNA的表達(dá),但抑制了多能性關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子oct3/4的mRNA表達(dá)。在撤除AdOx恢復(fù)培養(yǎng)的P

7、19細(xì)胞中,表達(dá)增加的多能性相關(guān)基因的mRNA水平逐漸下降,說明AdOx促進(jìn)多能性相關(guān)基因表達(dá)的增加是一過性的。Western Blot結(jié)果顯示,20μM AdOx增加了P19細(xì)胞中Nanog蛋白的表達(dá)量,但降低了Oct3/4蛋白的表達(dá)量。在恢復(fù)培養(yǎng)的P19細(xì)胞中,Nanog蛋白的表達(dá)量并未持續(xù)升高。AdOx對P19細(xì)胞中多能性基因表達(dá)產(chǎn)生了不同影響。
　　 經(jīng)20μM AdOx預(yù)處理過的P19細(xì)胞在加RA誘導(dǎo)中,干性基因的mR

8、NA表達(dá)水平仍能夠迅速下降。但是,在RA誘導(dǎo)的第1天,經(jīng)20μM AdOx預(yù)處理過的P19細(xì)胞中l(wèi)in28和fgf4的mRNA表達(dá)水平高于未處理細(xì)胞中的水平,可能會對RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞的神經(jīng)分化有一定干擾。
　　 3.AdOx引起了P19細(xì)胞分化潛能的改變
　　 我們發(fā)現(xiàn)AdOx嚴(yán)重影響了P19細(xì)胞多能性的維持,但卻限制了向神經(jīng)方向分化的潛能,為了研究AdOx是否引起了P19細(xì)胞向其他胚層的分化,我們采用Realtime

9、 RT-PCR技術(shù)檢測了AdOx處理后的P19細(xì)胞中多胚層轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,AdOx活化了P19細(xì)胞中多胚層標(biāo)志基因的表達(dá),包括內(nèi)胚層的Gam6和Sox17,中胚層的Hand1和Brachyury,外胚層的Pax6以及滋養(yǎng)層的Bmp4和Cdx2。說明AdOx引起了P19細(xì)胞分化潛能的改變,并且與多能性基因一過性增加相類似,在撤除AdOx后恢復(fù)培養(yǎng)1天和2天的細(xì)胞中,mRNA表達(dá)增加的多胚層標(biāo)志基因并沒有繼續(xù)增加,而是

10、逐漸下降。提示AdOx處理的P19細(xì)胞可能最終也并未分化為某一特定胚層的細(xì)胞。
　　 我們在20μMAdOx預(yù)處理過的P19細(xì)胞中,加入RA誘導(dǎo)2天,利用Real timeRT-PCR技術(shù)檢測多胚層標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)胚層的Gata6和Sox17,中胚層的Braehyury,外胚層的Nestin以及滋養(yǎng)層的Bmp4和Cdx2的mRNA水平均高于未經(jīng)AdOx處理過的P19細(xì)胞。提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能干擾了P19細(xì)胞

11、向神經(jīng)方向的特異分化。
　　 4.AdOx在P19細(xì)胞多能性維持中染色質(zhì)水平的調(diào)控作用
　　 組蛋白甲基化修飾在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持和基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用。AdOx作為一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑廣泛抑制了多種蛋白質(zhì)的甲基化過程。我們采用Western Blot方法檢測了AdOx對P19中多種組蛋白甲基化修飾的影響,結(jié)果顯示,在總?cè)旧|(zhì)水平上,多種組蛋白的甲基化修飾明顯下降,包括H3K27me3,H3K9me3,H3K4me2

12、,H4K20mel,H4K20me3,H3R17me2,H3R2me2,H4R3me2,提示AdOx改變了P19細(xì)胞中的組蛋白修飾模式。
　　 基因表達(dá)的活化必然伴隨著其調(diào)控區(qū)上抑制性修飾的下降。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AdOx處理的P19細(xì)胞中,抑制性的甲基化修飾包括H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在被AdOx活化的多能性相關(guān)基因和發(fā)育基因上均有不同程度的下降,在被AdOx抑制的oct3/4基

13、因上下降不明顯。提示AdOx可能是通過介導(dǎo)了抑制性甲基化修飾的降低引起了多能性相關(guān)基因和多胚層標(biāo)志基因的活化。同時,H4K20mel,H4K20me2和H4K20me3在這些基因上的募集水平均高于IgG,提示H4K20的甲基化修飾也可能參與了這些基因的表達(dá)調(diào)控。
　　 啟動子活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AdOx促進(jìn)了nanog的啟動子活性,抑制了oct3/4的啟動子活性,與AdOx對nanog和oct3/4 mRNA的影響一致。提示AdO

14、x是在轉(zhuǎn)錄水平上影響了這兩個基因的差異表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,抑制性的甲基化修飾H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在nanog基因多位點(diǎn)上均下降,而在oct3/4基因多位點(diǎn)上并無明顯下降,提示AdOx可能是通過介導(dǎo)抑制性的甲基化修飾差異調(diào)控了P19細(xì)胞中nanog和oct3/4基因的表達(dá)。
　　 5.AdOx對P19細(xì)胞粘附分子的影響
　　 E-Cadherin和N-Cadhe

15、rin是細(xì)胞中最常見的兩種粘附分子。Real time RT-PCR結(jié)果表明,AdOx促進(jìn)了e-cadherin粘附分子的表達(dá),而對神經(jīng)分化特異的n-cadherin粘附分子幾乎沒有顯著影響。
　　 6.AdOx對P19細(xì)胞神經(jīng)分化潛能為不可逆抑制
　　 將用較低濃度AdOx(5μM)處理P19細(xì)胞1天,撤除AdOx繼續(xù)恢復(fù)培養(yǎng)2天后,再加RA誘導(dǎo)神經(jīng)分化。Real time RT-PCR結(jié)果表明,神經(jīng)分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)

16、錄因子Ngn1,Mash1和NeuroD的mRNA水平仍被明顯抑制。提示AdOx對P19細(xì)胞神經(jīng)分化潛能的抑制不可逆。并且,在用20μM AdOx處理1天后恢復(fù)培養(yǎng)10天的P19細(xì)胞巾,內(nèi)胚層的Gata6,中胚層的Brachyury,外胚層的Pax6和Nestin以及滋養(yǎng)層的Cdx2的mRNA水平均明顯低于正常培養(yǎng)的P19細(xì)胞中的mRNA水平。提示,AdOx處理過的P19細(xì)胞可能已不再是正常的具有分化潛能的P19細(xì)胞。
　　 7

17、.蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1可能在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化過程中起作用
　　 Western Blot檢測顯示CARM1在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化早期明顯增加,且免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CARM1入核明顯,提示CARM1可能在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞的神經(jīng)分化過程中起作用。
　　 綜合以上結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)AdOx限制了P19細(xì)胞的神經(jīng)分化潛能,引起了P19細(xì)胞周期的阻滯,影響了P19細(xì)胞的自我更新和多能性維持能力。AdOx可能通過抑