1、乳酸菌是一類能夠利用碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱，是一群由多個屬組成的龐雜細菌群體，主要包括乳球菌屬(Lactococcus)，乳桿菌屬（Lactobacillus），片球菌屬(Pediococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。大多數乳酸菌對人體有益，它們通過降解糖類、蛋白和脂肪產生多種生物活性物質促進人體健康。此外，大部分

2、乳酸菌本身就是益生菌(probiotics)，其益生性質體現在維持人體腸道菌群平衡、調節(jié)人體免疫以及抑制有害病原微生物的生長等多個方面。
　　 乳酸菌有些益生功能與細菌表面性質有關，比如絮凝(aggregation)、黏附(adhesion)、自溶(autolysis)等。自溶（自裂解），是指細菌在生長繁殖的某個階段因肽聚糖水解酶（自溶酶）的作用而引起的自身裂解的現象。自溶酶除了裂解細胞發(fā)生自溶外，還參與細菌生長代謝的多個生理過

3、程，如新合成肽聚糖的延伸、細胞增大以及子代細胞的產生等，是一類極其重要的細胞壁水解酶類。研究表明，有些抗生素、細菌素的抗菌作用也是通過肽聚糖水解酶的活性而完成的，因此對肽聚糖水解酶的深入認識對于揭示乳酸菌的益生作用以及充分發(fā)揮抗生素的殺菌作用尤為重要。
　　 除了作為益生菌劑，乳酸菌還是重要的工業(yè)微生物菌株，在食品加工、乳制品發(fā)酵等領域具有悠久的應用歷史，是公認的安全級(GenerallyRegardedasSafe，GRAS)

4、微生物。有些乳酸乳球菌和乳桿菌作為發(fā)酵劑廣泛應用于奶酪的生產。其中，奶酪的成熟過程是一個緩慢而昂貴的過程，而乳酸菌發(fā)酵劑的自溶釋放出的脂肪酶、蛋白酶有利于風味物質的形成和奶酪的成熟，因此實時控制和深入認識自裂解機制是加速奶酪成熟的有效手段。截至目前，很多研究都著重于通過基因工程的方法構建可控裂解的乳酸乳球菌發(fā)酵劑菌株從而達到控制與縮短奶酪成熟時間的目的。而遺憾的是，發(fā)酵劑菌株的過度裂解會導致正常細胞數量減少，從而引起乳糖的過量剩余和奶酪

5、性質的不穩(wěn)定。所以，在非發(fā)酵劑菌株（主要指乳酸桿菌）中構建可控裂解系統(tǒng)可有效避免上述問題的發(fā)生。
　　 乳酸菌基因組小、代謝簡單、蛋白酶活力弱、易于進行人工改造等特征使其成為微生物學及分子生物學研究中的重要模式菌株。其中乳酸乳球菌已建立起較完善的遺傳操作系統(tǒng)，利用嚴謹型啟動子NisA可控表達系統(tǒng)(thenisin-controlledexpression，NICE)已實現了多種異源蛋白的表達。由于乳酸菌是單分子膜，遺傳操作系統(tǒng)可

6、控性強，它還是膜蛋白表達的良好宿主。
　　 本論文主要以乳酸乳球菌與干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)為實驗材料，以自溶性質以及膜蛋白表達為研究重點，構建了一個新的高效乳酸菌膜蛋白表達載體，實現了綠色巴夫藻△4去飽和酶和嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶在乳球菌中的過量表達;并且對乳酸菌的自溶性質以及相關肽聚糖水解酶的鑒別與生物特性進行了研究和探討。具體的工作內容和取得的結果如下:
　　 1.多不飽和脂肪酸合成相關功

7、能基因的克隆與表達
　　 多不飽和脂肪酸是人體所必需卻不能自然合成的重要營養(yǎng)物質，其相關合成基因的克隆和表達是研究者關心的熱點。本文以綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)為材料，通過反轉錄、SEFA-PCR(self-formedadaptorPCR)、SOE(splicingbyoverlapextension)等方法分別擴增得到了在EPA（二十碳五烯酸）與DHA（二十二碳六烯酸）合成中起重要作用的△5去飽和酶和△4去飽

8、和酶的基因全長及表達序列。與之前實驗室克隆和特征化的C20延伸酶（△5延伸酶）一起，完成了對綠色巴夫藻中EPA和DHA合成所涉關鍵基因的全部克隆工作。其中，△4去飽和酶與其同源蛋白有75％的同源序列。為了研究該酶的性質，在嘗試以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主利用多種載體表達△4去飽和酶時均沒有成功，主要原因是膜蛋白的過量表達對宿主細胞有毒害作用。隨后，將來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、能夠自動折疊于細胞膜的整合型膜蛋白

9、短肽Mistic與△4去飽和酶進行融合連接，結果實現了△4去飽和酶在大腸桿菌的過量表達。目的蛋白條帶在SDS-PAGE中顯著可見，此研究成為真核微藻多不飽和脂肪酸去飽和酶基因在原核生物中高效表達的首個成功例證。
　　 2.乳酸乳球菌高效膜蛋白表達載體的構建與應用
　　 膜蛋白對真核與原核細胞的生命活動具有重要作用，比如信號傳導、能量轉換、營養(yǎng)物質轉運等。在已測序的基因組中，膜蛋白占據所有開放閱讀框(ORF)的20％到25

10、％?？墒窍啾扔诳扇艿鞍椎难芯?，已明確結構特征和生化基礎的膜蛋白數量很少，而通過異源表達制備具有高分辨率結構的膜蛋白則更是屈指可數。阻礙膜蛋白研究的一個重要瓶頸就是膜蛋白過量表達。在Mistic介導△4去飽和酶在大腸桿菌表達工作的基礎上，進一步以乳酸乳球菌為宿主，以pNZ8148為骨架，結合Mistic結構元件構建了一個膜蛋白表達載體pNM110，探討和改進膜蛋白在乳酸乳球菌中的表達。通過Mistic與GFP的融合表達和GFP熒光的檢測，

11、證實了短肽Mistic可以成功插入乳酸乳球菌的細胞膜，并且具有促進膜蛋白過量表達的潛力。為了驗證該載體在乳球菌中表達膜蛋白的有效性，將克隆自綠色巴夫藻的△4去飽和酶基因pkjDes4和嗜酸乳桿菌的亞油酸異構酶基因pkjLi分別與Mistic融合連接，構建了重組載體pNMDes4和pNMLi，并成功實現了上述兩種膜蛋白在乳酸乳球菌中的過量表達，其表達水平分別達到了膜蛋白總量的4.4％與45.2％，這個表達水平是目前以乳酸乳球菌為宿主表達膜

12、蛋白產量最高的。為了進一步驗證所表達亞油酸異構酶的功能，將重組的乳酸乳球菌菌株與底物亞油酸在一定條件下培養(yǎng)，結果發(fā)現重組乳酸菌具有轉化亞油酸生成共軛亞油酸的能力，產量可達0.852mg/ml，轉化率為28.4％，該結果首次實現了乳桿菌亞油酸異構酶的異源表達和功能鑒定。
　　 3.乳酸菌自溶性質的研究
　　 細菌編碼的自溶酶除了用于細胞分裂產生子代細胞外，對于乳酸菌來說，還有一個重要的作用是在乳酪成熟中釋放出胞內水解酶類而

13、有助于風味物質的形成和縮短成熟時間;同時自溶酶具有對病原微生物的殺菌效果而可作為殺菌劑用作菌種保藏。因此對自溶酶和自溶表型的研究為乳酸菌的研究熱點之一。本文采用GM17和MRS選擇培養(yǎng)基，結合不同培養(yǎng)條件，先后從發(fā)酵乳、雞腸道和人糞便等不同生境中分離得到了多株乳酸菌并對其自溶能力進行了測量和篩選。結果發(fā)現，同種細菌不同菌株之間的自溶能力有顯著差異，這說明自溶具有高度菌株特異性。此外，糞腸球菌的自溶能力明顯強于乳酸乳球菌。以抗生素為代表的

14、生長抑制劑的使用是誘發(fā)細菌自溶現象的一個重要途徑。本文檢測了多種生長抑制劑在不同生長時期對乳酸乳球菌自溶性質的影響。結果表明，某些抗生素能夠在碳源嚴格限制性培養(yǎng)基中對處于特定生長時期的乳酸乳球菌產生顯著裂解的現象，而且抑制細胞壁合成類抗生素的促自溶效果更為明顯，這些結果對于研究抗生素與乳酸菌自溶的關系以及乳酸菌自溶的調控機制提供了實驗依據。
　　 4.干酪乳桿菌肽聚糖水解酶AclB的鑒別與生物特性研究
　　 相比于乳酸乳

15、球菌，除了植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的Acm2外，尚無乳桿菌肽聚糖水解酶鑒別與生物特性研究的報道。本文以干酪乳桿菌為研究對象，鑒別并克隆到5種推定的肽聚糖水解酶（自溶酶）基因，并對非內肽酶的基因在指數生長時期的不同階段的表達情況做了測定，發(fā)現它們在指數期的轉錄量有著相似的變化趨勢。隨后，AclA與AclB分別在大腸桿菌中進行了大量表達和純化。酶活性質測定表明，AclB在pH5.0的酸性條件下具有最大的水解

16、活性，而最適溫度是37℃，此結果與乳酸乳球菌肽聚糖水解酶AcmB、AcmC的酶活性質相似。為了研究AclB在細胞分離中的作用，使用自殺性整合載體對干酪乳桿菌S1的AclB基因進行了敲除失活。結果發(fā)現敲除后的乳桿菌除了在自溶能力以及自絮凝能力上有變化外，最顯著的特征是部分突變菌體拉長或者扭曲，表明AclB在細胞分裂后的分離中起著重要的作用。本文首次對乳桿菌的肽聚糖水解酶做了全面的鑒別和分析，并首次對干酪乳桿菌中的AclB酶進行了生物特性研

17、究，為該菌株的后續(xù)應用研究奠定了基礎。
　　 5.干酪乳桿菌可控裂解系統(tǒng)的建立及在奶酪發(fā)酵中的潛在應用
　　 干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑或非發(fā)酵劑乳酸菌株(non-starterlacticacidbacteria，NSLAB)應用于切達奶酪等多種奶酪的發(fā)酵生產中。建立干酪乳桿菌可控裂解系統(tǒng)可實現胞內酶的快速釋放，同時可保持發(fā)酵劑一定的活細胞數，是加快奶酪成熟的有效途徑。本文選用了來自于乳酸乳球菌的AcmA與來自于糞腸球菌的A

18、tlA兩種自溶酶，以NICE系統(tǒng)為基礎，以干酪乳桿菌為宿主分別構建了兩個可控裂解體系。在nisin的誘導下，AcmA與AtlA均能夠成功表達并水解細胞壁，從而裂解干酪乳桿菌細胞并釋放出胞內蛋白。為了進一步驗證該體系在奶酪生產中的應用潛力，我們進行了實驗室規(guī)模的模擬奶酪實驗，在使用AtlA裂解體系的奶酪凝乳中檢測到了5倍于對照組的乳酸脫氫酶活性，這標志著更多的胞內酶在生產過程中被釋放到凝乳中。此外，在整個模擬奶酪實驗中，所使用的發(fā)酵菌株乳