1、乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱，廣泛存在于自然界中，被公認(rèn)為是安全的食品級(generallvregarded as safe，GRAS)微生物。黏膜系統(tǒng)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，利用細菌載體接種黏膜表面誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)水平的有效免疫應(yīng)答，是有效預(yù)防從黏膜入侵傳染因子的方法之一。減毒活菌疫苗不適用于所有人群，并有恢復(fù)毒力的危險；而用乳酸菌作為活菌疫苗載

2、體能有效的避免以上問題。利用乳酸菌作為活菌疫苗載體能順利通過胃到達腸黏膜，刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有望成為新型疫苗。在乳酸菌中，可以作為活菌疫苗載體有乳桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)。用乳桿菌作為活菌載體表達外源抗原時，可能會產(chǎn)生免疫耐受。而乳球菌不是人體腸道的正常菌，不會產(chǎn)生免疫耐受。 國內(nèi)外有用乳酸菌進行重組蛋白表達和活菌疫苗研究的報道，但缺乏系統(tǒng)研究。國內(nèi)相關(guān)研究較少。 用增強型

3、綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為報告基因，比較了兩種啟動子的啟動效果。酸誘導(dǎo)啟動子P170受到自身代謝產(chǎn)生的H<'+>和生長量的誘導(dǎo)，即在pH低于6.5和在穩(wěn)定期時誘導(dǎo)表達，不需要額外加入誘導(dǎo)物，宿主菌的菌體生長期和表達蛋白的生產(chǎn)期分開。P<,nisA>啟動子是一個誘導(dǎo)效果很強的啟動子，受到NisK和NisR的調(diào)控。nisin是一種安全的食品添加劑，其作為誘導(dǎo)物時的濃度在

4、一定范圍內(nèi)與外源蛋白表達量呈正比例關(guān)系，容易控制。分別將egfp放在P170和P<,nisA>啟動子后構(gòu)建胞內(nèi)和胞外表達載體，電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌(Lc．lactis)中，用SDS-PAGE檢測及熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)無論是胞內(nèi)表達還是胞外表達，P<,nisA>啟動子的啟動效果均強于P170啟動效果。 將pα置于P<,nisA>啟動子后構(gòu)建胞內(nèi)和胞外表達載體，電轉(zhuǎn)化入Lc．lactisl．2030中。用ELISA檢測到PA的胞外表達情

5、況，在培養(yǎng)12小時后檢測到PA的表達，在16小時后趨于穩(wěn)定：Western Blotting檢測到胞內(nèi)PA的表達，用SDS-PAGE檢測PA隨時間變化的關(guān)系，加入誘導(dǎo)物后4小時有表達，在16小時候趨于穩(wěn)定。胞內(nèi)表達效果較胞外表達效果好。同時構(gòu)建了在PA的N端和C端含6個His-tag的表達載體。為了避免抗性基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒的不穩(wěn)定行，利用組氨醇磷酸化酶基因(hisB)作為同源交換序列，以pMD18-T為基礎(chǔ)構(gòu)建了在Lc．lacti

6、s中的自殺型整合載體pHEC。隨后將P<,nisA>啟動子和pa插入hisB正中間構(gòu)建了含pa的自殺整合型載體pHEC-Pnis-PA，不含分泌信號肽基因，表達的PA不分泌到胞外。隨后篩選得到了單交換突變體Lc．lactisl．2030S和雙交換突變體Lc．lactisl．2030D，用SDS-PAGE檢測有PA的表達。同樣的用乳桿菌表達載體在植物乳桿菌(Lb．plantarum)中表達了N端含有6個his標(biāo)簽的PA。 實驗結(jié)果