1、目的：利用家蠅與人類機會性致病真菌白假絲酵母菌(Candida albicans)的互作探討宿主與病原體的相互作用，篩選家蠅(Musca domestica)幼蟲中腸應對白假絲酵母菌侵染的應答基因，研究家蠅3日齡幼蟲中腸圍食膜蛋白質(zhì)組成成分以及在應對白假絲酵母菌侵染后的變化，進一步對其中篩選的圍食膜蛋白基因（Md Pt1）進行研究，為深入研究家蠅幼蟲腸道抵御真菌侵染的分子機制提供理論基礎。
　　方法:
　　1.采用新一代高通

2、量測序技術對經(jīng)口感染白假絲酵母菌和空白對照的家蠅幼蟲中腸進行測序分析，并篩選差異表達基因；利用生物信息學工具對轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因進行了功能注釋、分類以及參與的信號通路展示。應用熒光定量PCR技術驗證選定的20個差異表達基因。
　　2.解剖健康家蠅3日齡幼蟲中腸圍食膜，并解剖白假絲酵母菌侵染24h后（MD-T）和PBS對照組（MD-C）的圍食膜，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分離提取的圍食膜蛋白，將整條泳道上的蛋白從頂?shù)降浊懈?，膠在酶

3、解消化后做液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。
　　3.用RT-PCR方法從家蠅cDNA中獲取Md Pt1基因，利用生物信息學分析工具預測、分析基因編碼的蛋白質(zhì)的結構與生物學功能。將Md Pt1基因克隆到原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠制備免疫血清。用蛋白印跡（Western Blotting）方法檢測重組蛋白的幾丁質(zhì)結合特性。
　　結果：
　　1.在

4、白假絲酵母菌侵染24h后，中腸上皮組織通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學分析，共獲得3121個差異表達基因，其中表達上調(diào)基因1501個，下調(diào)基因1620個;通過對差異表達基因的GO分析，有2531個差異表達基因能夠GO富集，在生物過程本體顯著富集的是代謝過程、蛋白質(zhì)水解和氨基聚糖的代謝過程；在細胞組分本體顯著富集的是蛋白酶體核心復合體、蛋白酶體復合體以及細胞外區(qū)域；在分子功能本體中顯著富集的是催化活性、溶菌酶活性以及水解酶活性。KEGG Pat

5、hway分析發(fā)現(xiàn)，共有1809個DEGs能夠富集到115個代謝通路，差異基因主要參與到營養(yǎng)物質(zhì)代謝、氧化磷酸化以及免疫調(diào)節(jié)等通路。通過對選取的20個DEGs進行qRT-PCR分析驗證結果表明，所選基因表達模式與高
　　通量測序結果完全一致。
　　2.從健康的3日齡幼蟲圍食膜共鑒定到374個蛋白質(zhì)，分子量分布在8.225kDa至996.065kDa之間，等電點為3.83至11.24之間。家蠅幼蟲飼喂白假絲酵母菌24h后解剖PM

6、并提取蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定，在MD-T與MD-C組中分別有335、302個蛋白被成功鑒定，共有409個不重復蛋白質(zhì)，其中MD-T組單獨鑒定蛋白質(zhì)221個，MD-C組單獨鑒定蛋白質(zhì)188個，兩組同時表達114個，與對照相比，兩組中分子量小于30kDa的條帶差異變化明顯，顯示這些蛋白在家蠅幼蟲對白假絲酵母菌的免疫過程中發(fā)揮了重要作用。鑒定到的大多數(shù)差異蛋白蛋白質(zhì)主要涉及免疫、消化與營養(yǎng)代謝以及PM結構有關。根據(jù)GO注釋分析顯示，這些蛋白質(zhì)主要

7、參與模式識別結合、多聚糖的結合，圍食膜的結構組成和幾丁質(zhì)結合等相關功能。
　　3.成功獲得Md Pt1基因，cDNA全長1063bp，其開放閱讀框ORF長711bp，編碼236個氨基酸，N端有20個氨基酸的信號肽序列；其蛋白質(zhì)理論分子量為26503.7 Da，等電點為4.65；結構預測分析顯示其包含3個ChtBD2結構域。RT-PCR檢測顯示Md Pt1只在家蠅幼蟲表皮、中腸和氣管中有表達。Md Pt1蛋白具有幾丁質(zhì)結合活性，并只

8、能夠被強變性劑6M尿素和2％SDS+5%β-巰基乙醇洗脫，屬于PM第三類蛋白。
　　結論：
　　1.成功建立白假絲酵母菌侵染家蠅幼蟲的腸道感染，比較轉(zhuǎn)錄組學分析獲得參與免疫應答相關基因；
　　2.374個PM蛋白在健康的家蠅3日齡幼蟲被鑒定，白假絲酵母菌侵染24h后，在MD-T和MD-C分別鑒定到335、302個PM蛋白,白假絲酵母菌侵染后圍食膜的變化比較大；
　　3.成功克隆Md Pt1基因，驗證其具有幾丁質(zhì)結