1、家蠅(Musca domestica)從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)均生活在雜菌橫生的環(huán)境里，其體表帶有多種病原菌，可以傳播多種疾病。據(jù)報(bào)道約有100多個(gè)可引起人類(lèi)和動(dòng)物疾病的病原體與家蠅有關(guān)，包括傷寒、霍亂、桿菌性痢疾、肺結(jié)核、炭疽熱、嬰兒腹瀉和一些寄生蟲(chóng)病等。雖然家蠅沒(méi)有脊椎動(dòng)物那樣高度專(zhuān)一的免疫系統(tǒng)，但是在細(xì)菌感染或者其它物理、化學(xué)因子的誘導(dǎo)下，其體內(nèi)可以快速生成免疫活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)主要包括多種抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等。研究表明，家蠅體內(nèi)的

2、活性物質(zhì)不僅對(duì)多種病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)具有殺傷和抑制作用，同時(shí)對(duì)多種癌細(xì)胞也具有殺傷和抑制作用，但是大部分對(duì)人體是比較安全的。昆蟲(chóng)體內(nèi)活性物質(zhì)的抗菌、抗癌作用是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫研究的熱點(diǎn)之一。目前這些研究主要集中在果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)棕尾別麻蠅(Boettcherisca peregrinas)等中，已經(jīng)分離出了多種具有抗菌和抗癌作用的抗菌肽及其它

3、活性物質(zhì)。在家蠅中的相關(guān)研究相對(duì)較少。因此，對(duì)家蠅的免疫系統(tǒng)的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 本研究利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究分析了家蠅幼蟲(chóng)血淋巴在細(xì)菌刺激前后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。除了在昆蟲(chóng)中已報(bào)道的免疫反應(yīng)蛋白，還確定了幾種新的參與免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。本研究還利用抑制性消減雜交的方法構(gòu)建了家蠅cDNA消減文庫(kù)，得到數(shù)個(gè)免疫相關(guān)基因和氧化還原酶系相關(guān)基因。為進(jìn)一步克隆家蠅免疫相關(guān)基因提供了有價(jià)值的信息。然后通過(guò)同源克隆的方法從

4、家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)克隆得到了銅/鋅超氧化物歧化酶基因，分析了它在細(xì)菌刺激不同時(shí)間后的轉(zhuǎn)錄模式，并通過(guò)原核表達(dá)的重組蛋白制備了家兔多克隆抗體，研究了該蛋白在不同組織中翻譯模式，最后檢測(cè)了該蛋白的活性。同時(shí)，通過(guò)RT-PCR方法分析了另一個(gè)免疫相關(guān)的泛素融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄模式，并通過(guò)原核表達(dá)獲得了純化的泛素融合蛋白，擬進(jìn)一步分析其性質(zhì)。這些研究使我們對(duì)家蠅的先天免疫反應(yīng)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，為了解家蠅獨(dú)特的免疫防御機(jī)制提供了理論依據(jù)。 本研究

5、取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析了細(xì)菌免疫刺激后家蠅幼蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌免疫家蠅幼蟲(chóng)后，用雙向凝膠電泳的方法來(lái)檢測(cè)血淋巴中蛋白質(zhì)表達(dá)。在雙向電泳圖譜中共檢測(cè)到350個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，288個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在免疫刺激前后沒(méi)發(fā)生變化，11個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)免疫刺激后上調(diào)，37個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)免疫刺激后下調(diào)，14個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)只在免疫刺激后幼蟲(chóng)血淋巴樣品中能檢測(cè)到。MALDI-TOF-M

6、S共鑒定了35個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括7個(gè)免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)，如革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白1，肽聚糖識(shí)別蛋白LF，核因子NF-kB p110亞基和溶菌酶X。除了在昆蟲(chóng)中已報(bào)道的免疫反應(yīng)蛋白，還確定了幾種新的可能與免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括類(lèi)DCN1樣蛋白和cAMP依賴(lài)的蛋白激酶。另外還有一些參與解毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)也被鑒定出來(lái)，如超氧化物歧化酶，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，細(xì)胞色素P450等。RT-PCR分析了溶菌酶X，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和超氧化物歧化酶在mR

7、NA水平上的變化，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)在細(xì)菌刺激之后轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)變化與翻譯水平的變化是基本一致的的。上述結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)可能參與了家蠅的先天免疫反應(yīng)，為了解家蠅獨(dú)特的免疫防御機(jī)制提供了理論依據(jù)。 2.應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建家蠅幼蟲(chóng)差異表達(dá)cDNA消減文庫(kù)。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌液刺激的家蠅三齡幼蟲(chóng)與未刺激的同齡家蠅幼蟲(chóng)為消減雜交對(duì)象，分別提取mRNA，合成cDNA，刺激的為測(cè)試子(tester)，不刺激的為驅(qū)趕子(d

8、river)，經(jīng)兩次消減雜交及兩次抑制性PCR后就分離出測(cè)試子中差異表達(dá)cDNA片段，將差異表達(dá)cDNA片段與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得cDNA消減文庫(kù)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR篩選部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及GenBank BLASTx分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)cDNA片段大部分分布于200-750bp之間，并篩選出數(shù)個(gè)免疫相關(guān)基因和氧化還原酶系相關(guān)基因的EST，如防御素基因、細(xì)胞色素氧化酶基因、溶菌酶基因、絲氨酸蛋白酶基因、過(guò)氧化氫酶基因、氧

9、化還原酶基因，Dicer等。從而為家蠅免疫相關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。 3.根據(jù)GenBank上檢索的Cu/Zn SOD mRNA序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物克隆得到基因全長(zhǎng)。Cu/Zn SOD基因全長(zhǎng)為734bp，包含462bp的開(kāi)放閱讀框?；虻?’端含有9bp的非編碼區(qū)，3’端含有263bp的非編碼區(qū)，同時(shí)還有一個(gè)17 bppolyA尾巴。這一基因編碼的蛋白質(zhì)由153個(gè)氨基酸構(gòu)成。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SMART預(yù)測(cè)，其中包含一個(gè)為Sod_

10、Cu結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有信號(hào)肽，預(yù)測(cè)分子量為15.6kDa，理論等電點(diǎn)為5.67。 為了進(jìn)一步確認(rèn)家蠅幼蟲(chóng)Cu/Zn SOD基因的轉(zhuǎn)錄模式，還利用RT-PCR的方法研究了在混合菌刺激后不同時(shí)間段這一基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示在細(xì)菌刺激后3h，Cu/Zn SOD表達(dá)開(kāi)始增加，6h時(shí)增至最高值，至12h又有明顯的下降。這一變化趨勢(shì)說(shuō)明在家蠅幼蟲(chóng)受到外界刺激后Cu/Zn SOD基因上調(diào)表達(dá)。這一結(jié)果與家蠅幼蟲(chóng)血淋巴的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析所得到的結(jié)

11、果一致。根據(jù)Cu/Zn SOD基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，將基因片段克隆到pGEX-4T-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白在上清中，沒(méi)有形成包涵體，用Glutathione Sepharose 4B親和柱直接進(jìn)行純化。利用重組表達(dá)并純化的Cu/Zn SOD作為抗原免疫家兔，制備多克隆抗體。 利用SOD多克隆抗體研究了SOD蛋白在不同組織中的表達(dá)模式。將細(xì)菌刺激前后家蠅血淋巴、中腸、脂肪體蛋白進(jìn)行SD

12、S-PAGE并轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜后，用SOD抗血清作為一抗，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，天然的SOD蛋白主要存在于中腸和脂肪體中，在血淋巴也有較弱的表達(dá)。細(xì)菌刺激之后，在各組織中的表達(dá)都上調(diào)，但是在血淋巴中的上調(diào)較微弱。 10％非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行酶的活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu/Zn SOD活性在IPTG誘導(dǎo)3h以后，顯示出明顯的酶活性條帶，純化的Cu/Zn SOD也

13、具有明顯的酶活性條帶。誘導(dǎo)前也有較弱的活性，可能轉(zhuǎn)化菌株存在少量滲漏表達(dá)。 4.本研究還對(duì)家蠅泛素融合基因(Mubs27)在細(xì)菌刺激之后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并進(jìn)行了重組表達(dá)研究，擬進(jìn)一步分析其性質(zhì)。RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌刺激家蠅幼蟲(chóng)之后Mubs27表達(dá)上調(diào)。通過(guò)蛋白質(zhì)組分析在家蠅體內(nèi)鑒定出了免疫相關(guān)蛋白NF-κB，它在細(xì)菌免疫之后誘導(dǎo)表達(dá)。Mubs27可能在激活NF-κB的過(guò)程中起了重要的作用，而NF-