1、本論文重點(diǎn)研究了假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)34 kD纖溶酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)，并做了一些枯草桿菌表達(dá)方面的研究。主要研究結(jié)果如下: 本實(shí)驗(yàn)室顧從土壤中分離篩選出具有纖溶酶活性的假蕈狀芽孢桿菌，且對此菌株的纖溶酶蛋白進(jìn)行分離純化，得到34kD單一活性組分，埃德曼降解法測得N端序列為VTGTNAVGTGKGVLG。 根據(jù)此十五個(gè)氨基酸在NCBI上進(jìn)行比對，找到了十種100％同

2、源蛋白序列，并根據(jù)相對應(yīng)的編碼序列的同源性設(shè)計(jì)了一對簡并引物，并在5'端分別加入了EcoRI和XhoI的酶切位點(diǎn)。以產(chǎn)纖溶酶的菌株假蕈狀芽孢桿菌的基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，獲得了一個(gè)完整的兩頭含酶切位點(diǎn)的纖溶酶基因BpFE。 使用EcoRI和XhoI雙酶切載體pGEX-4T-2和BpFE基因，通過連接構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-BpFE，并對BpFE基因進(jìn)行了測序。結(jié)果表明:此細(xì)菌纖溶酶基因全長1701 bp，編

3、碼566個(gè)氨基酸。與相似性最高的序列bacillolysin(Bacillus cereusH3081.97)比僅存在5個(gè)氨基酸的差異，含有中性鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。 將重組質(zhì)粒pGEX-BpFE利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG、低溫誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示胞內(nèi)含有表達(dá)條帶，表達(dá)產(chǎn)物的相對分子量大小為98kD，比預(yù)計(jì)的分子量(90kD)稍大。酪蛋白平板法和纖維蛋白板法均顯示1.0 mmol/L IPTG

4、，26℃和30℃誘導(dǎo)5小時(shí)后的重組菌經(jīng)超聲波破壁后的胞內(nèi)蛋白有活性。 但是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大部分為胞內(nèi)表達(dá)，這樣就為生產(chǎn)帶來了很多的不便。而枯草芽孢桿菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)和分泌異源蛋白的理想受體。 以pUC19-5-2為模板，通過PCR方法得到含sacB基因的啟動子、200bp的類似轉(zhuǎn)錄終止信號的序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及編碼29個(gè)氨基酸的信號序列，將此535bp序列通過酶切連接到大腸-枯草穿梭質(zhì)