1、目的： 1．探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養(yǎng)和體外擴增方法。 2．研究其在當歸注射液或β—巰基乙醇(β—Mercaptoethanol，BME)誘導劑誘導下向神經(jīng)元細胞分化的能力，以提供一種較好的誘導方案。 3．明確堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)在誘導劑定向誘導過程中所起的作用，以優(yōu)化誘導方案

2、。 4．觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、體外擴增及定向誘導分化為神經(jīng)元樣細胞過程中的生物學特性，為今后臨床研究提供良好的種子細胞來源。 方法： 無菌條件下取大鼠骨髓，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法分離出成年大鼠MSCs，進行體外培養(yǎng)、擴增，觀察其生物學特性。取生長良好的第5代MSCs經(jīng)堿性成纖維生長因子(bFGF)預誘導后用當歸注射液或β—巰基乙醇(β—Mercaptoethanol，BME)誘導MSCs向神經(jīng)元樣

3、細胞分化，并針對堿性成纖維生長因子(bFGF)在誘導過程所起作用設(shè)立三組實驗對照組，包括對照組1：預誘導液中不含bFGF和誘導液中不含當歸注射液或BME誘導劑；對照組2：預誘導液中含bFGF，而誘導液中不含當歸注射液或BME誘導劑；對照組3：預誘導液中不含bFGF，而誘導液中含有當歸注射液誘導劑。倒置顯微鏡下觀察誘導過程中細胞形態(tài)所發(fā)生的變化，并通過細胞免疫化學法鑒定經(jīng)各組誘導后所得細胞的神經(jīng)干細胞標志物神經(jīng)巢蛋白(neuroepith

4、elial stem cell protein，Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron—specific Enolase，NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)的表達。經(jīng)鏡下計數(shù)誘導分化后所得細胞的陽性表達率，用統(tǒng)計學q檢驗方法比較各組之間的差異。 結(jié)果： 大鼠MSCs可用貼壁培養(yǎng)篩選法成功分離并在體外大量擴增。經(jīng)當歸注射液或BME誘導，MSCs可

5、向神經(jīng)元樣細胞分化，均出現(xiàn)胞體和突起，細胞免疫化學染色神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，巢蛋白(Nestin)陽性，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)呈陰性。且經(jīng)堿性成纖維生長因子(bFGF)預誘導的當歸組較未經(jīng)bFGF預誘導的對照組3誘導成神經(jīng)元樣細胞的陽性細胞表達率明顯提高。 結(jié)論： 貼壁分離培養(yǎng)法分離的MSCs能在體外培養(yǎng)條件下生長良好、可連續(xù)傳代，體外培養(yǎng)擴增能力較強，以當歸注射液或β—巰基乙醇作用于MSCs可成功誘