1、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(ListeriaMonocytogenes，Lm)是一種短小的革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動(dòng)物患李斯特菌??；單增李斯特菌為食源感染菌中的低溫菌，其生長(zhǎng)溫度在1～45℃之間，并可在肉類(lèi)、蛋類(lèi)、禽類(lèi)、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等多種食物中生長(zhǎng)。 單增李斯特菌中毒在臨床上主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和孕婦流產(chǎn)等，嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染。最近幾年，李斯特菌病在發(fā)達(dá)國(guó)家病死率高達(dá)20％～30

2、％；在美國(guó)，李斯特菌病被列為7種主要的食源性致死病之一；因此引起衛(wèi)生界的高度重視，被WHO評(píng)選為食品安全工作計(jì)劃?rùn)z測(cè)中的重點(diǎn)食源性疾病之一。檢驗(yàn)檢疫部門(mén)、衛(wèi)生局、海關(guān)、醫(yī)院等衛(wèi)生檢測(cè)防疫部門(mén)已經(jīng)努力構(gòu)建有關(guān)單增李斯特菌的檢測(cè)方法。 該項(xiàng)研究主要討論了免疫膠體金技術(shù)、PCR檢測(cè)技術(shù)在單核李斯特菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用。 免疫膠體金層析技術(shù)方法構(gòu)建：采用檸檬酸三鈉改良法制備15nm膠體金顆粒，確定標(biāo)記pH為8.2～9.0之間；單增

3、李斯特菌抗體最適蛋白質(zhì)添加量分別是：OⅠ型28μg、OⅠ/Ⅱ型28μg、OⅣ型25μg、OⅤ/Ⅵ型16μg、OⅥ型21μg、OⅦ型21μg；運(yùn)用硝酸纖維膜層析條帶、玻璃纖維、吸水材料、PVC底板組裝檢測(cè)試劑條。檢測(cè)方法：將待檢樣品與免疫膠體金混合，在層析試紙條上通過(guò)層析作用，與固定在硝酸纖維膜上的單核李斯特菌抗體和羊抗鼠IgG發(fā)生抗原抗體顯色反應(yīng)。 PCR檢測(cè)技術(shù)方法構(gòu)建：基于單增李斯特菌特異性的iap基因和hlya基因，建立P

4、CR檢測(cè)方法，分別設(shè)計(jì)了引物iap-1和iap-2，hlya-1和hlya-2；在36μlddH2O，5μl10×PCRbuffer，3μl25mmol/LMgCl2，4μldNTPs，0.1μl引物，0.5μl菌液反應(yīng)體系下，建立適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)程序，對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：免疫膠體金技術(shù)能有效地對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，并具有快速，方便等特點(diǎn)，可制成試劑條運(yùn)用于各個(gè)檢疫部門(mén)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在8～15min內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果，可檢驗(yàn)出不同血清

5、型的單增李斯特菌；缺點(diǎn)：對(duì)低濃度的單增李斯特菌檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低，在菌體濃度為107cfu/mL以上，檢出率高達(dá)85.7％，低于這個(gè)濃度，不能檢出，會(huì)產(chǎn)生一定比例的假陰性。PCR技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌具有較高的靈敏度，能夠?qū)Φ蜐舛鹊膯卧隼钏固鼐鷮?shí)施快速檢測(cè)；iap基因的擴(kuò)增檢出靈敏度為106cfu/mL；針對(duì)hlya基因的擴(kuò)增檢出靈敏度可達(dá)104cfu/mL。運(yùn)用hlya基因擴(kuò)增可檢出，105cfu/mL菌液濃度模擬感染的豬肉；但不能區(qū)