1、一、背景與目的
　　 腸上皮屏障功能損害是嚴重燒傷早期病理生理變化的重要機制之一。嚴重燒傷后受應激、缺血缺氧、炎癥反應等的影響，全身腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）等炎癥細胞因子釋放急劇增加，同時腸道局部組織也產生大量細胞因子。這些細胞因子與燒傷后發(fā)生的腸道屏障功能損害有什么關系，它們是否參與燒傷后腸道屏障功能損害的發(fā)生，如果參與，其分子機制又是什么，目前的研究資料尚不能完全回答這些

2、問題。
　　 過去的研究表明，IFN-γ、TNF-α、IL-1β等細胞因子可以單獨或協同引起腸上皮屏障功能損害，細胞因子可通過誘導腸上皮細胞肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chainkinase, MLCK）蛋白表達，引起肌球蛋白輕鏈（myosin light chain, MLC）磷酸化水平增加，導致細胞緊密連接（tight junction, TJ）相關蛋白ZO-1、occludin、claudin-1改變，從而

3、損害腸上皮屏障功能。但是，細胞因子誘導腸上皮細胞MLCK蛋白表達增加的分子機制還不完全清楚。
　　 缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是調節(jié)機體對缺氧適應性反應的重要核轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成。HIF-1α亞基由氧濃度調節(jié)表達，HIF-1β亞基則持續(xù)表達。近年的研究發(fā)現，HIF-1α在免疫應答及炎癥反應的調控中也具有重要作用。氧濃度并非是調節(jié)HIF-1

4、α的唯一因素，在常氧條件下炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β等對HIF-1α的蛋白積聚、DNA 結合活性及其靶基因的表達均有重要調節(jié)作用。因此，我們假設：作為一種既參與缺氧適應性調控反應又在炎癥反應調控中起重要作用的核轉錄因子，HIF-1α有可能通過調控腸上皮細胞MLCK蛋白表達，從而參與IFN-γ及TNF-α協同引起的腸上皮屏障功能損害。本課題利用體外單層腸上皮細胞模型，研究HIF-1α是否通過誘導腸上皮細胞MLCK蛋白表達而參與了I

5、FN-γ及TNF-α協同引起的腸上皮細胞屏障功能損害，以進一步闡明嚴重燒傷后腸上皮屏障功能損害的分子機制。
　　 二、方法
　　 1．以體外培養(yǎng)的人腸上皮細胞株Caco-2 單層為研究對象，用IFN-γ（10ng/mL）或/與TNF-α（10ng/mL）處理腸上皮細胞單層。用異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FITC-dextran）熒光示蹤法檢測腸上皮細胞單層的通透性，電阻測定儀檢測跨腸上皮細胞單層電阻（TER），免疫熒光法

6、檢測TJ蛋白ZO-1及occludin分布形態(tài)的變化，用蛋白質免疫印跡法檢測HIF-1α、ZO-1、occludin、MLCK蛋白表達以及MLC 磷酸化的變化。
　　 2．研究分別應用HIF-1α抑制劑寡霉素（40μg/mL）及YC-1（400μmol/L）抑制HIF-1α
　　 蛋白表達對IFN-γ與TNF-α處理引起的腸上皮細胞單層通透性、TER、TJ蛋白分布形態(tài)、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表達以及MLC

7、磷酸化的影響。
　　 3．研究采用RNA 干擾技術沉默HIF-1α基因對IFN-γ與TNF-α處理引起的腸上皮細胞單層通透性、TER、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表達以及MLC 磷酸化的影響。
　　 三、主要結果
　　 1．IFN-γ或TNF-α單獨作用對腸上皮細胞單層TER、TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形態(tài)、HIF-1α蛋白表達、MLCK蛋白表達以及MLC 磷酸化無明顯影響；而IFN-γ

8、r>　　 及TNF-α協同作用則引起腸上皮細胞單層通透性明顯增加，TER 顯著降低，TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形態(tài)不規(guī)則，而且occludin在細胞漿內分布明顯增加，即發(fā)生重新分布，HIF-1α蛋白表達、MLCK蛋白表達以及MLC 磷酸化明顯增加；但是，IFN-γ或TNF-α
　　 無論單獨還是協同作用，對腸上皮細胞單層TJ蛋白occludin的蛋白表達含量均無明顯影響。
　　 2．HIF-1α抑制劑寡霉

9、素能減輕IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮屏障功能損害，表現在寡霉素能改善IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮細胞單層通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形態(tài)改變。同時，寡霉素能明顯抑制IFN-γ
　　 及TNF-α協同作用引起的腸上皮細胞單層HIF-1α蛋白表達、MLCK蛋白表達以及MLC磷酸化水平增加。
　　 3．HIF-1α抑制劑YC-1也能減輕IFN-γ及TNF-α協同作

10、用引起的腸上皮屏障功能損害，表現在YC-1能改善IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮細胞單層通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形態(tài)改變。同時，YC-1能明顯抑制IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮細胞單層HIF-1α蛋白表達、MLCK蛋白表達以及MLC磷酸化水平增加。
　　 4．采用RNA 干擾明顯抑制腸上皮細胞HIF-1α表達后，IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮屏障功能損害包

11、括腸上皮細胞單層通透性增加及TER降低均得到明顯減輕，同時IFN-γ及TNF-α協同作用引起的腸上皮細胞單層MLCK蛋白表達及MLC 磷酸化水平增加基本恢復至正常。
　　 四、結論
　　 1．IFN-γ與TNF-α協同作用引起腸上皮屏障功能損害、TJ蛋白ZO-1及occludin形態(tài)發(fā)生改變尤其是occludin 重分布、MLCK蛋白表達增加以及MLC 磷酸化水平增加，同時伴有HIF-1α蛋白表達增加。HIF-1α可能是

12、IFN-γ與TNF-α協同引起腸上皮屏障功能損害的重要介質。
　　 2．HIF-1α抑制劑寡霉素及YC-1均能減輕IFN-γ與TNF-α協同作用引起的腸上皮屏障功能損害、TJ蛋白ZO-1及occludin 形態(tài)發(fā)生改變、MLCK蛋白表達增加以及MLC磷酸化水平增加。HIF-1α參與了IFN-γ與TNF-α協同作用引起的腸上皮屏障功能損害的發(fā)生。
　　 3．沉默HIF-1α基因能減輕IFN-γ與TNF-α協同作用引起的腸上