1、分類號：Q936密繳：(秘密、機密、絕密)學校代碼：10057研究生學號：12812509溫控型啟動子在酶的重組表達中的應用TheApplicationofTemp—regulatedPromotertecombinantEnzyme專業(yè)名稱：微生物與生化藥學(理)指導教師姓名：黎明副教授研究生姓名：李楊申請學位類別：理學碩士論文提交日期：2015年5月論文課題來源：國家“863”計劃學位授予單位：天津科技大學摘要控制基因轉錄與結合的關

2、鍵部件是基因上游序列，即啟動子。通過改變特定基因的啟動子序列即可達到改變特定基因轉錄方式與特征，并由此探討基因轉化方式變化的細胞相關生理特征的可能改變，進而探索新的基因功能呈現(xiàn)與可能應用。為此，本研究通過基因替換方式，特定改變基因的啟動子序列，通過實驗證實改變后的突變株相關生理屬性的可能改變，探討未來基因表達調控的新型模式。膜結合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(mPQQGDH，ECl152)是一種重要的氧化還原酶，因其在血糖診斷及葡萄

3、糖傳感器中的重要應用而受到廣泛的關注。運用基因定點替換方式，對大腸桿菌的膜結合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(mPQQGDH)編碼基因的啟動子序列實施更換，成功獲得突變體EscherichiacoliB0013120／pGCd：：KmPLPR，突變體的mPQQGDH表達受控于溫度誘導型啟動子PLPR，重組菌的酶活比出發(fā)菌株提高了212％。同時對其發(fā)酵條件和誘導條件進行了優(yōu)化，得到的結果為重組酶的最適孵育溫度為25℃，最適pH為60，誘

4、導前菌體密度為氏oo=16，最佳誘導溫度為42℃，最佳誘導時間為4h。賴氨酸脫羧酶是生物法合成戊二胺的關鍵酶。運用上述相似的方法，將誘導型賴氨酸脫羧酶編碼基因的啟動子序列用溫度誘導型啟動子PLPR進行了成功的替換，獲得了相應的突變體EcoliB0013120／pLDC：：pLpelBs，并添加信號肽使胞內酶賴氨酸脫羧酶分泌到細胞周質空間表達。結果表明：重組菌株轉化賴氨酸生成戊二胺的效率略高于出發(fā)菌株，但誘導過程中不用添加誘導劑，通過溫度