1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，是1996年繼TNF-α，F(xiàn)as之后新發(fā)現(xiàn)的一種能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的TNF超家族成員，為Ⅱ型跨膜蛋白，全長為281個氨基酸，由胞漿區(qū)(14aa)、跨膜區(qū)(26aa)和胞膜外區(qū)(241aa)組成；胞膜外區(qū)有蛋白酶作用位點(diǎn)，可以被從膜上剪切下來，形成可溶性分子。TRAIL在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)并有五種受體：死亡受體DR4，DR5，誘騙受體DcR1，DcR2及OPG，其受體表達(dá)和分布特性表明它與TN

2、F及Fas有不同的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，由于它可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞基本無影響，故被認(rèn)為是一個極具潛力的凋亡誘導(dǎo)因子。但也有研究表明，TRAIL也對部分人正常細(xì)胞敏感，例如人肝細(xì)胞。為此，我們利用凋亡抑素(survivin)啟動子調(diào)控IL-2信號肽引導(dǎo)的TRAILcDNA功能區(qū)表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。該方法的應(yīng)用將Trail表達(dá)限定在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而最大限度地降低TRAIL對正常組織細(xì)胞的損害。 目的：構(gòu)建

3、凋亡抑素(survivin)啟動子調(diào)控IL-2信號肽與TRAIL融合基因真核表達(dá)載體，探討其在宮頸癌特異性、靶向性誘導(dǎo)凋亡的作用。 方法：(1)利用已獲得的帶有TRAILcDNA片斷的表達(dá)質(zhì)粒pRNDE2-1和IL-2信號肽基因序列，擴(kuò)增IL-2信號肽和TRAIL的融合基因，克隆入帶有survivin啟動子的真核表達(dá)載體pGL3Basic/Surp啟動子下游，構(gòu)3建survivin啟動子調(diào)控的TRAIL基因真核表達(dá)載體pGL3B

4、asic/Surp/Trail。(2)用該重組載體經(jīng)陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，RT-PCR及Westernblot法鑒定Hela細(xì)胞中Trail表達(dá)。(3)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖曲線觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀技術(shù)(FCM)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化，TUNEL染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。 結(jié)果：(1)經(jīng)測序，限制性酶切分析及PCR方法鑒定，目的基因被成功插入表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了真核表達(dá)

5、載體pGL3Basic/Surp/Trail。(2)經(jīng)RT-PCR及Westernblot鑒定，轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞表達(dá)目的基因蛋白，而ECV304細(xì)胞未見Trail基因表達(dá)。(3)pGL3Basic/Surp/Trail轉(zhuǎn)染的ECV304細(xì)胞相比較，pGL3Basic/Surp/Trail轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞生長速度減慢、倍增時間延長，F(xiàn)CM顯示Hela細(xì)胞出現(xiàn)凋亡峰，同時TUNEL染色顯示陽性凋亡細(xì)胞。 結(jié)論：人可溶性腫瘤壞死