1、本文改進(jìn)了一種可以利用錯(cuò)配修復(fù)蛋白TthMutS直接從細(xì)菌基因組中檢測(cè)出未知突變的方法。利用這個(gè)方法，我們檢測(cè)了一株具有氯霉素高水平抗性表型的銅綠假單胞菌突變株中存在的突變，表明氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶catB7基因中181位和314位的A/G轉(zhuǎn)換使該菌株呈現(xiàn)了高水平氯霉素抗性。對(duì)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶CATB7蛋白突變體的進(jìn)一步研究表明，突變體比活性未見(jiàn)提高，但增加了它在細(xì)胞內(nèi)的累積量，初步揭示了該銅綠假單胞菌突變株對(duì)氯霉素抗性水平提高的分子基

2、礎(chǔ)。 考慮到錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutS是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中最關(guān)鍵的起識(shí)別和結(jié)合錯(cuò)配的作用的一個(gè)蛋白，近年來(lái)開發(fā)出一系列基于大腸桿菌MutS蛋白的突變檢測(cè)方法。然而，這些方法大多是設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)合成的寡核苷酸片段或者PCR擴(kuò)增片段中的已知突變，這就大大限制了這些方法的實(shí)用性。此外，體外試驗(yàn)表明，大腸桿菌MutS蛋白并不能有效區(qū)分所有錯(cuò)配類型。而來(lái)源于嗜熱微生物Thermusthermophilus的錯(cuò)配修復(fù)蛋白TthMutS，能在高達(dá)6

3、0℃的溫度范圍內(nèi)有效識(shí)別所有8種類型的堿基錯(cuò)配和1到3個(gè)堿基的缺失或者插入引起的錯(cuò)配，因而在突變檢測(cè)中有更大的潛力。 我們介紹了一種可以利用TthMutS直接從細(xì)菌基因組中檢測(cè)出未知突變的方法。野生型的基因組DNA和突變型的基因組DNA混合在一起，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后變性再?gòu)?fù)性，所產(chǎn)生的含有錯(cuò)配堿基的異源雙鏈DNA片段用TthMutS來(lái)結(jié)合，并經(jīng)Ni-NTAHis-Bind()樹脂親和層析來(lái)回收。回收的DNA片段克隆到載體中，形

4、成一個(gè)含有錯(cuò)配片段的微型文庫(kù)。進(jìn)一步的DNA測(cè)序和遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該方法在從細(xì)菌的基因DNA中檢測(cè)未知突變是有效的。利用這個(gè)方法，我們檢測(cè)了一株具有氯霉素高水平抗性的銅綠假單胞菌突變株中存在的突變，表明氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶catB7基因中181位和314位的A/G轉(zhuǎn)換使該菌株呈現(xiàn)了高水平氯霉素抗性。同以前同類方法相比，該方法能夠比較容易地在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)未知突變，傳統(tǒng)的依賴于PCR擴(kuò)增、凝膠電泳或構(gòu)象變化的突變檢測(cè)方法是不適用這個(gè)目的

5、的。傳統(tǒng)的細(xì)菌遺傳學(xué)產(chǎn)生了大量表型已知而基因型未知的突變菌株，本文發(fā)展的方法在鑒定這些突變菌株的基因型方面將發(fā)揮很大的作用。 氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因cat在大多數(shù)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌中都存在，CAT蛋白通過(guò)乙?；饔檬Щ盥让顾?，這是細(xì)菌抗抗生素機(jī)制中了解得最為清楚的一種途徑。我們?cè)谝恢昃哂懈咚铰让顾乜剐员硇偷你~綠假單胞菌中，檢測(cè)到catB7基因存在了兩個(gè)點(diǎn)突變，181A/G和314A/G，它們分別引起G61S和Y105C氨基酸

6、替換，并且證實(shí)了catB7突變基因是菌株高水平氯霉素抗性表型的主要決定子。我們進(jìn)一步從體外表達(dá)測(cè)活和體內(nèi)遺傳互補(bǔ)幾方面來(lái)鑒定這個(gè)突變基因的性質(zhì)，以期揭示這個(gè)抗性表型的分子基礎(chǔ)。 從野生型和突變型銅綠假單胞菌中分別擴(kuò)增catB7基因，克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，形成表達(dá)質(zhì)粒pETPaCATw和pETPaCATm，并利用定點(diǎn)突變獲得表達(dá)質(zhì)粒pETPaCATm181和pETPaCATm314。采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、變性純化和復(fù)性獲得

7、野生型和突變體氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶重組蛋白CATB7、CATB7G61S,Y105C、CATB7G61S和CATB7Y105C?；钚詼y(cè)定表明這四個(gè)重組蛋白的比活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)非常接近。與此相吻合的是，從最近發(fā)表的氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)可以看出，這兩個(gè)突變位點(diǎn)并非處于酶活性中心。通過(guò)構(gòu)建自殺質(zhì)粒、定點(diǎn)突變和遺傳互補(bǔ)獲得了catB7基因含有181A/G或314A/G單點(diǎn)突變的銅綠假單胞菌衍生菌株P(guān)Acr181和PAcr314。氯霉素敏感性