1、組織工程化口腔粘膜是近年來(lái)口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，本文通過(guò)體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，模擬組織工程化三維口腔粘膜的構(gòu)建，探索組織工程化口腔粘膜體外培養(yǎng)的方法。本研究主要包括以下三方面內(nèi)容:
　　1.原代細(xì)胞培養(yǎng)目的:通過(guò)組織塊法結(jié)合胰蛋白酶消化法培養(yǎng)、分離人口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。材料與方法:10例第三磨牙拔除時(shí)切除的齦瓣，大小約1×0.5 cm2/塊。將帶有上皮層和固有層的組織塊種植于培養(yǎng)瓶中，待組織塊細(xì)胞增殖后，

2、通過(guò)胰蛋白酶消化法分離獲得原代上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。通過(guò)在不同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步純化兩種細(xì)胞。采用免疫熒光和HE染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果:組織塊植入后的第2 d～3 d可看到組織塊周邊出現(xiàn)新分裂增殖的細(xì)胞，約14d細(xì)胞增殖范圍達(dá)到0.5 cm～1 cm后，進(jìn)行初次傳代。胰蛋白酶消化法可初步分離出上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。結(jié)論:組織塊法結(jié)合胰蛋白酶消化法能快速高效的培養(yǎng)分離口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，是一種實(shí)用的口腔粘膜細(xì)胞培養(yǎng)方法。<

3、br>　　2.支架篩選目的:篩選適合用于組織工程化口腔粘膜體外構(gòu)建的支架材料。材料與方法:將5組上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別種植于脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)、PEG、PVA三種生物支架上，培養(yǎng)2d后，采用CCK-8測(cè)定細(xì)胞活性，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。將成纖維細(xì)胞種植于三種生物支架上，培養(yǎng)1周后再將上皮細(xì)胞種植于支架上，繼續(xù)培養(yǎng)1周，HE染色及免疫組化觀察細(xì)胞在支架中的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果:統(tǒng)計(jì)分析顯示，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活性在三種生物材料中

4、均無(wú)明顯的差異(P＞0.05)。HE染色及免疫組化顯示，三種生物支架材料中，脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)中的細(xì)胞數(shù)目多，分布層次深，細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)較好。結(jié)論:三種生物支架中較適宜用于體外三維培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的是脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)。
　　3.組織工程化口腔粘膜體外預(yù)構(gòu)建目的:通過(guò)體外三維培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，模擬組織工程化口腔粘膜的構(gòu)建，探索組織工程化口腔粘膜體外培養(yǎng)的方法。材料與方法:將成纖維細(xì)胞種植于脫細(xì)胞異

5、體真皮基質(zhì)上，培養(yǎng)1周后再將上皮細(xì)胞種植于支架上，繼續(xù)培養(yǎng)1周后，將支架移至氣-液平面培養(yǎng)5d。HE染色及免疫熒光觀察口腔粘膜上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的情況。結(jié)果:免疫熒光及HE染色顯示，經(jīng)過(guò)2周的液下培養(yǎng)及5d的氣-液培養(yǎng)后，細(xì)胞可以深入生長(zhǎng)植入到支架全層，其中上皮細(xì)胞主要集中在支架表層及淺層，成纖維細(xì)胞主要分布在支架深層。結(jié)論:口腔粘膜上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞體外三維培養(yǎng)后細(xì)胞的分布狀態(tài)類似于口腔粘膜組織的基本分層，但細(xì)胞增殖數(shù)