1、背景：針對β-地中海貧血的α珠蛋白鏈相對過剩這一主要病理基礎(chǔ)，有研究報道應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)調(diào)控人α-珠蛋白基因表達(dá)，結(jié)果顯示α-反義寡核苷酸能有效地抑制體外培養(yǎng)的重型β-地中海貧血紅系細(xì)胞α-珠蛋白基因表達(dá)，改善珠蛋白基因α/β+γ的比例失衡。然而，對于人α-反義寡核苷酸治療β-地中海貧血的體內(nèi)試驗研究尚未見報道。
　　 目的：建立人源化水平較高的人源非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型，在此基礎(chǔ)上建立人

2、源β-地中海貧血小鼠模型，并構(gòu)建介導(dǎo)人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體，探討慢病毒載體介導(dǎo)α-反義寡核苷酸對人源β-地中海貧血小鼠模型的作用。
　　 方法：1、將人正常骨髓或臍血單個核細(xì)胞分別移植給經(jīng)不同方案和劑量預(yù)處理的NOD/SCID小鼠，移植后小鼠腹腔注射重組人細(xì)胞因子。觀察小鼠存活情況，移植6周后檢測小鼠骨髓及外周血人-CD45+細(xì)胞比例。
　　 2、將β-地中海貧血患者的骨髓單個核細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸注給經(jīng)全身照射預(yù)處

3、理的NOD/SCID小鼠，移植后小鼠腹腔注射重組人細(xì)胞因子。觀察小鼠體重等一般狀況，移植5周后取小鼠骨髓及外周血，檢測人CD45+細(xì)胞比例，并行血紅蛋白電泳、珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳、人β-地貧基因分析及透射電鏡觀察小鼠外周血及骨髓紅系細(xì)胞內(nèi)α-珠蛋白鏈的沉積情況，取小鼠的肝臟和脾臟行大體、普通病理及鐵染色檢查。
　　 3、針對人α-反義寡核苷酸序列，通過雙限制性內(nèi)切酶消化和連接的方法構(gòu)建pGCSIL-vshRNA-GFP載

4、體質(zhì)粒，接著該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌E.coliDH5α，通過PCR及基因測序鑒定陽性克隆，再經(jīng)Lipofectamine2000將pGCSIL-vshRNA-GFP，pHelper1.0和pHelper2.0三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒，通過綠色熒光蛋白的表達(dá)測定收集的病毒滴度。此外，同樣方法制備隨機序列慢病毒載體并包裝純化。
　　 4、將介導(dǎo)α-反義寡核苷酸的慢病毒載體，感染β-地中海貧血患者骨髓CD34+細(xì)胞后，

5、再輸注給經(jīng)全身照射預(yù)處理的NOD/SCID小鼠，并以輸注未經(jīng)感染的β-地貧骨髓細(xì)胞、感染隨機序列慢病毒的β-地貧骨髓細(xì)胞、正常骨髓CD34+細(xì)胞及空白小鼠為對照。觀察小鼠體重等一般狀況，移植6周后，取小鼠骨髓及外周血，檢測人CD45+細(xì)胞比例，并行血紅蛋白電泳及人β-地貧基因分析，取小鼠的肝臟和脾臟行大體、普通病理及鐵染色檢查。
　　 結(jié)果：1、全身照射(加或不加環(huán)磷酰胺)骨髓移植組和全身照射(加或不加環(huán)磷酰胺)臍血移植組小鼠輸

6、注人單個核細(xì)胞數(shù)分別為(0.6560±0.0089)×106和(4.0775±0.8450)×106。全身照射/環(huán)磷酰胺組死亡率均為100％，全身照射組死亡率均為33.3％，且全身照射劑量越大，死亡率越高。移植6周后，小鼠骨髓中人CD45+細(xì)胞的比例，全身照射臍血移植組13號和6號小鼠分別為59.61％和21.46％，而全身照射骨髓移植組2號和8號小鼠其比例均為0，空白對照組小鼠比例均為0。
　　 2、β-地中海貧血患者骨髓細(xì)胞

7、移植NOD/SCID小鼠5周后，檢測小鼠骨髓和外周血人CD45+細(xì)胞比例分別為：β-地貧/HbE骨髓移植組：7.21％、4.08％(+47天)，7.37％、6.03％(+61天)，β-地貧骨髓移植組：8.17％、3.43％(+36天)，16.82％、8.89％(+45天)。移植組小鼠血紅蛋白電泳可見HbA2條帶，肽鏈分析顯示α鏈的條帶要比β鏈的條帶濃和寬，β-地貧基因檢測結(jié)果與供者相符，部分紅系細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)電子致密物(過剩α-珠蛋白肽鏈)

8、沉積。移植組小鼠脾臟長度與其體重的比值比空白對照組的大[(0.5762±0.0451)vs(0.3628±0.0340)mm/g,P=0.000]，肝脾出現(xiàn)較明顯的鐵沉積。
　　 3、重組質(zhì)粒的外源基因PCR鑒定正確，基因測序結(jié)果與所需要的α-ASON序列完全一致，濃縮后慢病毒滴度為5×109TU/ml。
　　 4、慢病毒所感染的β-地貧骨髓細(xì)胞移植NOD/SCID小鼠，移植后6周各組小鼠與移植前體重比較：正常骨髓移植組

9、和空白對照組體重增加或顯著增加，而其余小鼠體重減輕或不增加。移植后6周各移植組小鼠骨髓和外周血能檢測到人CD45+細(xì)胞(0.01-8.39％)，且輸注β-地中海貧血患者細(xì)胞(不論是否輸注慢病毒感染細(xì)胞)的小鼠可檢測到與供者相符的人β-地貧突變基因，輸注β-地貧患者細(xì)胞的小鼠脾臟長度與其體重的比值比正常骨髓移植及空白對照組的大[(0.6848±0.0886)vs(0.5573±0.0088)mm/g，P=0.016]。在α-ASON-LV

10、感染β-地貧骨髓細(xì)胞移植組，肝脾(尤其脾)鐵沉積比β-地貧骨髓移植組和NC-GFP-LV感染β-地貧骨髓細(xì)胞移植組的程度輕。
　　 結(jié)論：在輸注造血干細(xì)胞數(shù)量達(dá)閾劑量的基礎(chǔ)上，盡可能提高預(yù)處理的強度，并使用人細(xì)胞因子可提高人源NOD/SCID小鼠模型的人源化水平。將β-地中海貧血患者骨髓單個核細(xì)胞移植給NOD/SCID小鼠，可建立人源化β-地中海貧血小鼠模型。所構(gòu)建介導(dǎo)α-反義寡核苷酸的慢病毒載體感染人β-地貧骨髓細(xì)胞植入NOD