1、糖尿病(diabetesmellitus)是胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂，臨床以高血糖、高血脂、高粘血癥為主要標志的全身慢性代謝性臨床綜合征。近年來，糖尿病本身及其并發(fā)癥對人們的身心健康危害重大，已經(jīng)成為現(xiàn)代流行疾病的第二殺手，僅次于癌癥對人類的危害。因此，尋找更好的糖尿病藥物和治療方法是人們致力攻克的一大難題。
　　 胰高血糖素樣肽-1(glueagon-likepeptide-1，

2、GLP-1）又稱促胰島素，它是一種通過與胰島β細胞表面的特異受體相互作用而使葡萄糖誘導的胰島素分泌顯著增強的短肽。GLP-1還能減少胰島細胞損傷，改善胰島細胞結構，修復胰島β細胞功能，抑制β細胞調亡，提高胰島細胞活力并延長其壽命，抑制胰升糖素的釋放，調控胰腺β細胞特異基因表達并通過這種基因調控改善葡萄糖轉運和代謝，提高β細胞對葡萄糖的反應性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能。GLP-1被認為是一種從根本上治療糖尿病的“治標治本”多功效的多

3、肽類激素，對糖尿病的治療具有重要意義。
　　 植物是最經(jīng)濟的生物反應器，允許表達產(chǎn)物蛋白亞細胞定位，正確折疊和轉錄后修飾。目前，利用轉基因植物已經(jīng)生產(chǎn)了許多藥用重組蛋白和肽類。黃瓜脆嫩味美，含糖量低，是糖尿病人理想的蔬菜及水果之一。
　　 盡管天然GLP-I對糖尿病具有很好的療效，但由于體內二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的快速降解和腎臟代謝作用，導致其半衰期很短（2～5min），成為限制其臨床應用的主要瓶頸。因而，研發(fā)

4、長效藥用GLP-1類似肽已成為學術界關注的一個熱點。本研究的目的是通過基因工程技術構建高效表達長效laGLP-1(long-actingGLP-1)、獲得對糖尿病具有預防和治療效果的轉基因黃瓜，使患者在食用美味黃瓜的同時對糖尿病起到預防和治療作用。為此，本研究使用了在生物活性高且消除了二肽酶IV(DPPIV)位點和胰蛋白識別位點的laGLP-1基因，其表達產(chǎn)物可用于口服或食用。并且，為實現(xiàn)IaGLP-1的高效表達，本研究首次構建了含十拷

5、貝IaGLP-1串聯(lián)重復融合基因的表達載體pX6-GLP-T。通過農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法和floraldip法對黃瓜自交系2M1進行轉化。獲得的轉基因黃瓜表達的多拷貝1aGLP-1融合蛋白食用后可被胃腸道內的胰蛋白酶切割釋放有效IaGLP-1單體，發(fā)揮其促進胰島素分泌和胰島修復功能，達到預防和治療糖尿病的作用，減輕糖尿病本身和打針吃藥給患者帶來的痛苦.
　　 本研究選用無抗生素選擇性標記基因(marker-free)的植物表

6、達載體px6，獲得的轉基因苗通過誘導重組剔除抗生素選擇性標記基因，從而獲得穩(wěn)定可靠、食用安全的轉基因黃瓜，保證其環(huán)境釋放和食用的安全性。
　　 在對黃瓜遺傳轉化過程中，通過對苗齡、生長激素種類及濃度等影響器官發(fā)生的因素進行研究，優(yōu)化了影響黃瓜子葉節(jié)經(jīng)器官發(fā)生途徑誘導叢生芽形成的重要因素，建立了高效、穩(wěn)定的黃瓜離體體細胞再生體系：以培養(yǎng)3-4天的無菌苗子葉節(jié)為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基為誘導培養(yǎng)基，附加BA2.0mg/L，NAA0

7、.5mg/L，ABA10mg/L，蔗糖60g/L，瓊脂7g/L。采用該體系外植體出芽率較高，可應用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化．對農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系進行優(yōu)化研究結果表明，農(nóng)桿菌侵染15min，共培養(yǎng)2天，采用前7天卡那霉素延遲篩選方法出芽率最高．
　　 本研究還采用農(nóng)桿菌介導、花粉管通道和floraldip等多種遺傳轉化方法對黃瓜自交系2MI進行了轉化。經(jīng)PCR及Southern雜交檢測，共獲得12株含有多拷貝laGLP-I基因

8、的轉基因黃瓜植株．其中，農(nóng)桿菌侵染的轉化率為0.2％，花粉管通道法的轉化率為0.09%，floraldip法的轉化率為0.52%。將獲得的轉基因植株經(jīng)過β-雌二醇的誘導后，得到了marker-free轉基因黃瓜植株．進行Westernblot分析，有2株植株呈陽性結果，分別命名為A1033，A1065。通過對A1065株系的后代進行分析，獲得5株成功表達多拷貝laGLP-1基因的后代。
　　 以AI065植株為材料，將黃瓜果實粉

9、碎，提取總蛋白，以其濃縮物溶解液灌喂高血糖Wistar大鼠。結果表明，兩個處理組口服多拷貝IaGLP-120天后，高血糖大鼠的血糖值均顯著下降，從24.5+-2.5mM降低到13.2+-3.3mM，而正常對照組和0.9%NaCl對照組的血糖值在實驗前后均無顯著變化．表明通過給高血糖大鼠灌服多拷貝laGLP-1蛋白后，融合蛋白在胃腸道中可被胰蛋白酶降解為IaGLP-I單體，進入血液循環(huán)進而降低了高血糖大鼠的血糖水平。同時也改善了模型大鼠的

10、飲食、飲水平衡。
　　 本研究還利用構建的植物病毒表達載體p35S-30B-GLP-T，采用葉片農(nóng)桿菌注射侵染法和根部吸收法兩種簡單、快捷的瞬時表達技術體系，在煙草中瞬時表達了多拷貝laGLP-1蛋白，并對瞬時表達外源蛋白的體系進行了優(yōu)化，結果表明當菌液重懸液MMAOD600=l.0時，多拷貝laGLP-1的表達效率較高，其表達量占總可溶性蛋白的0.4%左右。證明這種植物高效瞬時表達體系可能對采用植物生物反應器直接生產(chǎn)多肽類藥物