1、目的:目前心血管疾病是威脅人類生命的主要疾病之一。其中血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)由中膜遷移到內(nèi)膜下間隙并異常增生是動脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄、冠心病等疾病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowth factor,PDGF)是一種重要的促細(xì)胞有絲分裂劑,同時(shí)具有趨化活性和分裂活性,它可以誘導(dǎo)VSMC從中膜遷移到內(nèi)膜。PDG

2、F-BB是目前已知最強(qiáng)的VSMC體外趨化劑。VSMC從中膜遷移到內(nèi)膜的前提是需要將細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解掉。已知基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組鋅離子依賴的內(nèi)肽酶家族,由VSMC、巨噬細(xì)胞及其它一些細(xì)胞產(chǎn)生。它可以降解大部分ECM,為VSMC的遷移掃清道路。其中尤其以MMP-2最為重要,它可以降解ECM的主要成分,從而促進(jìn)VSMC的

3、遷移。Rho激酶(ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一,也是目前功能研究最為清楚的Rho下游靶效應(yīng)分子。它有兩種亞型,分別是ROCKⅠ和ROCKⅡ。大量研究證明,Rho/ROCK信號通路參與了細(xì)胞多種生理功能的調(diào)節(jié),例如,細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架重組以及其他炎癥反應(yīng),而這些細(xì)胞功能又與許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。ROCK的兩種亞型氨基酸序列具有65％的同源性,其中兩者激酶區(qū)的同源性高達(dá)92%。因此,一

4、般研究者認(rèn)為兩者在細(xì)胞內(nèi)的功能相同。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)ROCKⅠ和ROCKⅡ在某些細(xì)胞中具有不同的磷酸化底物,提示兩者的作用機(jī)制可能會有不同。目前,ROCK的兩種亞型在血管平滑肌細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制是否相同尚不明確。本文旨在研究PDGF介導(dǎo)ROCK亞型(ROCKⅠ和ROCKⅡ)對大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)及活性的影響。
　　 方法:(1)利用明膠酶譜法檢測MMP-2蛋白的活性:(2)利用

5、RNA干擾技術(shù),通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ROCK亞型的siRNA,使ROCKⅠ或ROCKⅡ基因表達(dá)下調(diào),并檢測基因下調(diào)后蛋白表達(dá)水平;(3)使用免疫印跡法(western blot)檢測MMP-2蛋白的表達(dá);(4)利用Boyden小室法,觀察ROCK I和ROCKⅡ蛋白表達(dá)下調(diào)后及ROCK抑制劑Y-27632對PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞遷移的影響;(5)利用細(xì)胞免疫熒光方法觀察細(xì)胞骨架變化情況。
　　 結(jié)果:(1)明膠酶譜顯示PDGF呈濃

6、度依賴性增加血管平滑肌細(xì)胞MMP-2的活性,并且在20ng/ml的時(shí)候達(dá)到高峰;(2)siRNA轉(zhuǎn)染后ROCKⅠ和ROCKⅡ別表達(dá)下調(diào)79.8%和70.1%;(3)PDGF介導(dǎo)下ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)均抑制MMP-2的表達(dá);(4)PDGF介導(dǎo)下ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)均抑制MMP-2的活性;(5)ROCKⅠ下調(diào)抑制VSMC遷移,ROCKⅡ下調(diào)抑制作用不明顯:(6)PDGF誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞偽足明顯增加,轉(zhuǎn)染ROCKⅠ和RO