1、背景:基質金屬蛋白酶-10(Matrix metallopeptidase10,MMP-10),又稱基質分解素-2(stromelysin2,SL-2),是基質金屬蛋白酶家族的成員之一,屬于鋅離子依賴的蛋白水解酶,其生物學功能主要是參與正常生理和疾病過程的細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的重構。有關MMP-10在心臟病心室重構中的作用及其信號轉導通路目前還不清楚。我們在先前的研究中發(fā)現(xiàn),心力衰竭患者的心肌組

2、織的MMP-10水平與左室舒張末期直徑呈正相關關系,提示MMP-10可能與心室重構關系密切。我們還發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌梗死后早期,心肌MMP-10的表達水平即可明顯升高,而心梗后早期為炎癥期。因此,我們提出假說,即炎癥因子可能促進MMP-10的表達。為了驗證這一假說,我們觀察了一些心梗后發(fā)生反應的主要炎癥因子對心肌細胞MMP-10表達的影響。預實驗的結果顯示,C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)對心肌細胞MMP-10的表

3、達上調作用最為明顯。而CRP作為重要的炎性細胞因子,可直接參與心梗的整個病理生理過程。在心梗后的早期,可促進參與心室重構的分子的產(chǎn)生,從而促進心梗后由炎癥期向增殖期的轉化,間接地促進心室重構。由此可見,MMP-10可能在炎癥引起的心梗后心室重構過程中起著重要作用。本課題在此基礎上重點研究和闡明CRP促進心肌細胞MMP-10表達的信號轉導通路及相關的調控機制。
　　 方法:(1)細胞培養(yǎng):1-3d SD大鼠,取其心臟,用胰蛋白酶消

4、化法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞。(2)CRP對心肌細胞MMP-10表達的影響:用CRP刺激心肌細胞,收集細胞培養(yǎng)上清,用酪蛋白酶譜法觀察心肌細胞培養(yǎng)上清中MMP-10的活性變化；提取細胞總RNA,應用熒光實時定量RT-PCR技術觀察心肌細胞中MMP-10的mRNA表達變化；提取細胞總蛋白,用蛋白免疫印跡雜交技術觀察心肌細胞中MMP-10的蛋白表達變化。(3)參與CRP誘導MMP-10表達變化的相關信號通路:應用特異的信號通路抑制劑,用蛋白免疫

5、印跡雜交技術檢測MMP-10的蛋白表達變化,并使用特異的信號分子的磷酸化抗體,用蛋白免疫印跡雜交技術檢測其信號通路的激活情況。(4)轉錄因子對MMP-10表達變化的作用:提取細胞核蛋白,應用濾板法檢測轉錄因子的DNA結合激活情況,并使用相應轉錄因子的siRNA,進一步分析轉錄因子對MMP-10的調節(jié)作用。
　　 結果:(1)確定了CRP對MMP-10的上調作用。不同濃度CRP刺激心肌細胞24h,均與對照組比較,以5μg/ml C

6、RP對細胞培養(yǎng)上清中MMP—10的活性增加的最高,比活為27076.34±138.78(mg·ml-1)-1(p<0.01,n=3)；以5μg/ml CRP作用不同時間,刺激24h的細胞培養(yǎng)上清的MMP-10活性增加最高,比活為10897.51±136.56(mg·ml-1)-1(p<0.01,n=3)；MMP-10 mRNA水平在12h達高峰(p<0.01,n=3)；MMP-10的蛋白水平呈現(xiàn)時間依賴性,24h可達到對照組的3.18倍

7、(p<0.01,n=3)。(2)進一步確定了參與CRP誘導心肌MMP-10表達的信號轉導通路。分別使用相應信號通路的特異性抑制劑,只有使用ERK1/2和JAK1的抑制劑能明顯阻斷CRP對MMP-10的表達上調。使用特異性磷酸化抗體來檢測各信號分子的磷酸化水平的激活效應,結果發(fā)現(xiàn),CRP可激活c—Raf/MEK/ERK級聯(lián)信號轉導通路的各信號分子的磷酸化水平,而相應的非磷酸化水平均不改變。另外,CRP還可激活JAK1和STAT3的Ser7

8、27[STAT3(S727)]的磷酸化水平,而相應的非磷酸化水平均不改變。使用JAK1的抑制劑可以降低ERK1/2的磷酸化水平,抑制MMP-10的蛋白表達和活性；使用ERK1/2信號通路抑制劑可以阻斷STAT3(S727)磷酸化水平的升高,抑制MMP-10的蛋白表達和活性。因此,c-Raf/MEK/ERK級聯(lián)信號轉導通路和JAK1/ERK信號通路共同參與調節(jié)CRP對MMP-10的表達上調。[3)從核蛋白水平,明確轉錄因子AP-1和STA

9、T3的結合活性。以5μg/ml CRP分別作用6h,12h和24h,AP-1的DNA結合活性,均有所增加,其中12h達高峰(p<0.05,n=3)；STAT3的DNA結合活性,也均有所增加,其中12h達高峰(p<0.01,n=3)。使用ERK1/2的抑制劑U0126既可以抑制AP-1的DNA結合活性(p<0.05,n=3),也可以抑制STAT3的DNA結合活性(p<0.01,n=3),從而明確了ERK1/2與轉錄因子AP-1和STAT3

10、之間的關聯(lián)。(4)使用siRNA技術,進一步明確轉錄因子AP-1和STAT3在CRP誘導MMP-10上調過程中的調節(jié)作用。分別轉染AP-1siRNA和STAT3siRNA干擾24h后,轉錄因子AP-1和STAT3的結合活性以及MMP-10的活性和表達均可被抑制。
　　 結論:(1)明確了CRP促進心肌細胞MMP-10表達上調的作用。(2)首次詳細地闡明了心肌細胞MMP-10表達調控的信號轉導通路:CRP通過激活c-Raf/MEK

11、/ERK級聯(lián)信號轉導通路和JAK1/ERK信號通路,促進轉錄因子AP-1和STAT3入核與MMP-10的啟動子區(qū)域相應的結合位點相結合,誘導心肌細胞MMP-10的表達上調。其中,ERK1/2在CRP誘導心肌細胞MMP-10上調的過程中,是關鍵的交點,對MMP-10的表達調控起到至關重要的作用。鑒于MMP-10在心室重構過程中發(fā)揮的重要作用,闡明MMP-10在心肌細胞中的信號通路,可以幫助我們有效地對MMP-10的活性和表達進行控制,從而