1、大蒜(Allium sativum L.)是重要的藥食兼用蔬菜，在世界范圍廣泛栽培和食用。由于大蒜栽培種主要利用鱗莖進行無性繁殖，極易產生病毒積累，從而導致產量和品質下降。利用組織培養(yǎng)技術脫毒是大蒜品種提純復壯的有效手段。然而大蒜試管苗培養(yǎng)過程中玻璃化現象嚴重，限制了這一技術在生產中的普遍應用。
　　試管苗玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中普遍存在的一種生理障礙。玻璃化試管苗呈現半透明水浸狀，其組織結構和生理功能異常，分化能力低下，難以成

2、芽和增殖，也難以生根成苗，移栽后成活率低，后期生長差，對植物脫毒、快繁及基因遺傳轉化影響嚴重，但其發(fā)生機制至今尚未明確。
　　研究發(fā)現，在試管苗玻璃化過程中同時存在活性氧物質(ROS)的產生和積累，更多的研究也證實試管苗玻璃化與活性氧代謝紊亂相關，但其相互關系及作用機理迄今少有報道。為了明確試管苗玻璃化過程中活性氧代謝特點，探究活性氧誘導試管苗玻璃化的生理和分子生物學機制，本研究以大蒜品種‘二水早’為材料，采用組織觀察、生理測定、

3、高通量測序等技術，從組織-細胞-分子等不同層次，探討活性氧與試管苗玻璃化、細胞器損傷、細胞膜異變和miRNAs及其靶基因表達的關系，進而揭示試管苗玻璃化的機理。主要研究結果如下:
　　1.在培養(yǎng)基中添加不同濃度（0、0.5、1.0、1.5和2.0mM）外源H2O2，觀察不同濃度下大蒜試管苗玻璃化發(fā)生差異及其生理特點。與其他濃度相比，1.5mMH2O2作用下的試管苗玻璃化率最高。同時，1.5mM H2O2處理使試管苗的組織含水量顯著

4、增加，葉綠素及可溶性蛋白含量顯著降低。SDS-PAGE電泳結果顯示，1.5 mM H2O2處理誘導試管苗產生了兩條新的蛋白譜帶，分子量分別為52 kD及110kD。同時，試管苗83 kD和105 kD的兩條蛋白譜帶表達量增強。
　　2.在培養(yǎng)基中添加1.5mMH2O2，隨著培養(yǎng)時間的延長，試管苗玻璃化率顯著提高，玻璃化程度明顯加重，葉綠體和線粒體結構發(fā)生損傷，亞細胞水平超氧陰離子產生速率(O2·-)和內源H2O2含量顯著提高。與其

5、他細胞器相比，質外體抗氧化系統(tǒng)響應脅迫最早，ROS產生和累積最顯著，說明質外體在試管苗氧化脅迫和玻璃化發(fā)生過程中具有重要作用。
　　3.利用外源H2O2和二碘基苯(DPI，NADPH氧化酶抑制劑)、疊氮化鈉(NaN3，POD抑制劑)以及雙辛胍胺（GUA，PAO抑制劑）處理大蒜試管苗，發(fā)現外源H2O2處理使試管苗質膜NADPH氧化酶、細胞壁POD及質外體PAO的活性均顯著增加，而抑制NADPH氧化酶、POD及PAO活性能夠顯著降低氧

6、化脅迫下試管苗玻璃化率、O2·-產生速率和H2O2含量，其中DPI對試管苗產生O2·-的抑制作用顯著高于NaN3和GUA。在整個處理期間，外源H2O2使質膜NADPH氧化酶活性始終呈現上升趨勢，而細胞壁POD及質外體PAO活性短暫提高后逐漸降低，說明質膜NADPH氧化酶是催化試管苗活性氧形成的重要氧化酶。
　　4.采用半液體培養(yǎng)、培養(yǎng)基中添加高濃度6-BA和外源H2O2誘導玻璃化試管苗，研究玻璃化苗細胞壁及細胞膜在結構、組成及其功

7、能的異常變化。結果發(fā)現，與正常試管苗相比，玻璃化苗細胞壁纖維素、木質素及果膠含量顯著降低，細胞膜不飽和脂肪酸指數和磷脂含量顯著降低;玻璃試管化苗細胞膜H+-ATPase活性、細胞膜流動性及細胞膜Ca2+含量顯著低于正常試管苗。說明玻璃化試管苗細胞壁和細胞膜結構與物質組成發(fā)生異常變化，并由此導致其功能的異常。
　　5.利用在培養(yǎng)基添加外源H2O2和不添加H2O2，構建氧化脅迫處理和正常培養(yǎng)（對照）2個小RNA文庫，利用miRNAs測

8、序技術，篩選和鑒定出大蒜試管苗響應氧化脅迫的353條保守miRNAs和76條新miRNAs，其中133條miRNAs在氧化脅迫下是顯著上調表達，76條miRNAs顯著下調表達。同時進行降解組測序和分析，發(fā)現21條保守miRNAs靶向26個靶基因家族，17條新miRNAs靶向3個基因家族。靶向蛋白質水解酶及乙烯轉錄因子的相關miRNAs上調表達，靶向ATP和膜蛋白基因的相關miRNAs下調表達。由此推測，差異表達miRNAs的靶基因主要在