1、背景:間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于胚胎早期中胚層和外胚層的多能干細胞，在體內廣泛分布。骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)具有支持造血、自我更新、多向分化、免疫調節(jié)、分泌因子等諸多功能，在組織再生、創(chuàng)傷修復和多種疾病的治療中有巨大潛力。然而由于BMSCs是一群不均一的細胞群體，其不同亞群的細胞表面抗原存在著差異。因此目前BMS

2、Cs表面標志物的篩選尚存爭議。BMSCs具有較強的自我更新能力。BMSCs的生長曲線呈S形，在傳代7代之前具有較好的生長特性。BMSCs具有多向分化能力。在不同的誘導條件下，BMSCs可分化為多種造血以外的組織細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞、星形神經膠質細胞等。此外，BMSCs還發(fā)揮著支持造血、調節(jié)免疫、分泌某些因子的作用。如轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)

3、、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等。
　　除了以上這些優(yōu)良特性，BMSCs

4、還易于提取，易于體外擴增，易于外源性基因的導入和表達。因此BMSCs有望成為細胞治療和基因治療的有力工具。在多種造血以外的缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病的治療中發(fā)揮重要價值。目前，自體干細胞移植是BMSCs應用于臨床的重要手段，它有如下一些優(yōu)勢:一、細胞源于每個病人自身，供體來源充足;二、無免疫排斥反應;三、治療費用相對低廉;四、無倫理學障礙。支持造血是體內BMSCs的主要生理作用之一。有報道稱自體BMSCs和外周血造血干細胞共移植

5、可用于治療惡性血液病。大量報道證實自體BMSCs移植在骨、軟骨、關節(jié)等創(chuàng)傷修復中的良好表現:自體BMSCs與同種異體骨支架復合可治療犬下頜骨節(jié)段性缺損;自體BMSCs與藻酸鹽載體復合可治療兔關節(jié)軟骨缺損;自體BMSCs與生物蛋白膠混合注射有利于兔前交叉韌帶重建的術后恢復;自體BMSCs經旋骨內動脈灌注可用于治療股骨頭缺血性壞死。一些研究發(fā)現自體BMSCs還可用于組織創(chuàng)傷或組織缺損的修復性治療:自體BMSCs可用于治療裸鼠皮膚創(chuàng)面;自體B

6、MSCs可以幫助重建兔受損的眼表，減輕水腫，抑制血管生成;自體BMSCs可用于進行犬膀胱部分切除修補。此外，自體BMSCs在一些缺血缺氧性損傷的治療中亦能發(fā)揮重要作用（盡管其作用機制尚未非常明確）:自體BMSCs局部注射可用于療小型豬心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）;經皮冠狀動脈介入術(percutaneouscoronary intervention，PCI)的同時行自體BMSCs冠脈灌注可以

7、抑制AMI患者的左心室重構，改善心功能;自體BMSCs局部注射可以改善下肢缺血的血流灌注;自體BMSCs可改善糖尿病足的局部癥狀。自體BMSCs亦可用于神經系統(tǒng)的修復:自體BMSCs靜脈注射可改善中樞神經系統(tǒng)損傷后神經功能障礙的癥狀;經靜脈自體BMSCs移植可用于治療腦梗死;自體BMSCs血腫腔內沖洗有助于腦出血的術后恢復;自體BMSCs可用于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的治療;自體BMSCs可以用于周圍

8、神經損傷的修復;自體BMSCs聯合外周神經移植術可用于治療脊髓損傷。然而，由于功能性神經元不僅要具備典型神經元細胞的形態(tài)特征和特異性標記，還應該具備可興奮性、形成突觸聯系的能力、產生突觸電位的能力等。因此，BMSCs的神經方向誘導是否成功尚存在很大的爭議。但是自體BMSCs在不同器官多種原因引起的功能障礙中也能夠發(fā)揮治療作用:自體BMSCs可用于治療豬急性肝功能衰竭;自體BMSCs移植可促進肝硬化SD大鼠模型殘余肝臟再生;自體BMSCs

9、可以緩解異基因小型豬的肝移植急性排斥反應;自體BMSCs移植可用于治療終末期肝病;自體BMSCs移植可以促進兔缺血再灌注損傷后腎臟功能的恢復和組織結構的修復;自體BMSCs移植可以在急性重癥胰腺炎早期保護大鼠免受損害;自體BMSCs移植聯合胰島素或降糖藥治療能有效降低患者血糖，并改善患者諸多臨床癥狀。
　　自體BMSCs移植是充分發(fā)揮BMSCs強大的組織修復、免疫調節(jié)、支持造血等功能的有效手段。因此，有很多學者致力于將BMSCs應

10、用于更廣泛的治療領域。然而自體BMSCs移植受供體年齡的影響很大，隨著人類年齡的增長，BMSCs也隨之發(fā)生著生理性老化。氧化應激理論認為，隨著人類年齡的增長，機體抗氧化系統(tǒng)失衡。隨著大量活性氧的釋放和積累，細胞逐漸老化甚至凋亡，對應的就是器官的衰退甚至衰竭。BMSCs也難逃這樣的規(guī)律。研究發(fā)現，胚胎BMSCs，增殖能力較強，體外培養(yǎng)時無接觸性抑制，但是分泌功能較差。而在成體BMSCs中，0-20歲之間的BMSCs生物學特性最優(yōu)。因此，是

11、良好的BMSCs來源。有人認為氧化應激學說并不能完美地解釋細胞老化現象，我們或許能夠找到一種能改善老化個體BMSCs生物學特性的方法。
　　低氧處理對BMSCs的作用是一個有趣的課題。它似乎給人們提供了一點希望。有人推測由于骨髓里的氧濃度低于其他組織，所以低氧環(huán)境更利于BMSCs的生長。一些實驗證實:3％O2的持續(xù)性低氧可促進人BMSCs的增殖;1％O2的持續(xù)性低氧可促進人BMSCs增殖，促進集落形成，促進低氧誘導因子-1α(hy

12、poxia-inducible factor-1，HIF-1α)的表達，促進基質細胞衍生因子-1(stromalcell-derived factor-1，SDF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，抑制BMSCs的成骨分化。但是也有相反的結論:低氧可促進含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs增殖，但是在無血清條件下則表現為抑制增殖;1％O2濃度是非致死性條件，但是可短暫

13、抑制大鼠BMSCs的增殖。因此，人們認為低氧處理對BMSCs的作用與氧濃度大小、作用持續(xù)時間、培養(yǎng)基中的血清濃度、物種等多種因素相關。
　　目的:適度的低氧處理可能會促進BMSCs的增殖。我們計劃在C57小鼠BMSCs上重復這種處理，并且將這種處理應用于增殖能力差的老化C57小鼠BMSCs上，以期促進其增殖。
　　方法:我們參考Billups-rothenberg公司的MIC101型細胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)，并作了相應改進。自制了一

14、套新型低氧培養(yǎng)裝置。這種裝置的設計原理是從普通培養(yǎng)箱中引入的含5％ CO2的混合氣體作為氣體來源，在“活性鐵—蛭石—活性炭原電池”消耗了其中的O2之后再供給BMSCs。和MIC101型細胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)相比，這種裝置無需連接鋼制氣瓶，使用時靈活方便安全可靠。這種裝置可以保證氣體的充分交換，保證測氧儀檢測結果的準確性。這種裝置可以在降低O2濃度的同時，維持CO2濃度的穩(wěn)定。根據The Jackson Laboratory提供的數據，C57小

15、鼠出生后3-6周相當于人類的20-30歲，C57小鼠出生后18-24個月相當于人類的56-69歲。我們選取3-6周C57小鼠作為年輕組，選取18-24個月C57小鼠作為老齡組。全骨髓法獲取3-6周年輕組C57小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)，通過換液、傳代等方法體外擴增至第6代。并且選取了其中部分細胞進行凍存。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作常規(guī)培養(yǎng)，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數目，繪制連續(xù)5天的細胞生長曲線，以證實年輕組C57小

16、鼠的BMSCs的增殖能力較強。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作成骨誘導和成脂誘導，以證實年輕組C57小鼠的BMSCs的仍然具有良好的多向分化能力，證實全骨髓法獲取C57小鼠BMSCs的可行性。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs于5％O2低氧下處理30min，繼而常規(guī)孵育8h。然后用結晶紫染色，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數目的變化。全骨髓法獲取18-24個月老化C57小鼠骨髓貼壁細胞作原代培養(yǎng)。于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數目，繪制連續(xù)

17、12天的細胞生長曲線。以證實隨著年齡的增殖，BMSCs的增殖能力減弱。全骨髓法獲取老化C57小鼠的BMSCs較為困難。取接種后72h的老化C57小鼠的骨髓貼壁細胞于5％O2低氧下處理30min，繼而常規(guī)培養(yǎng)24h，并用結晶紫染色，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數目的變化。
　　結果:3-6周年輕組C57小鼠BMSCs，可體外擴增至第6代，并且保持了多向分化能力。經5％O2低氧下處理30min后，呈片狀脫落。18-24個月老化C57小鼠的

18、骨髓貼壁細胞增殖能力差，經12天的原代培養(yǎng)僅形成了一個集落。經5％O2低氧下處理30min，并繼續(xù)培養(yǎng)24h后，貼壁細胞數量明顯減少，且無新的集落形成。
　　結論:利用全骨髓法可順利地獲取的年輕組C57小鼠的BMSCs。第6代年輕組C57小鼠BMSCs生長良好，并保持了多向分化能力。但低氧處理可損害年輕組的C57小鼠BMSCs的增殖。利用全骨髓法獲取老化C57小鼠BMSCs較為困難，低氧處理可損害老化C57小鼠骨髓貼壁細胞的原代培