1、5'-3'核糖核酸外切酶(XRN1)是一個在基因表達過程中與RNA代謝和RNA干擾等重要功能相關的保守酶大家族，存在于所有真核生物中，簡稱5PX。XRN1能持續(xù)降解5'端單磷酸的RNA，而不能對5'端三磷酸、5'帽子結構、5'羥基的RNA發(fā)揮作用。在總RNA中，rRNA含量最高，原核生物的16S與23SrRNA和真核生物18S與28SrRNA5'端均為單磷酸，末端核酸外切酶XRN1可將這些rRNA降解去除，而達到富集mRNA的目的。

2、r>　　 已知釀酒酵母S288c的Xrn1基因序列長4587bp，編碼1528aa。通過生物學軟件對其蛋白分子量和等電點進行預測，得出分子量約為175kDa，等電點在7.3左右。本論文利用畢赤酵母表達系統(tǒng)重組表達釀酒酵母S288c的XRN1，篩選高效表達XRN1重組蛋白的體系，同時優(yōu)化基礎鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，進行擴大培養(yǎng)及誘導表達，并分離純化重組蛋白，鑒定重組酶活性，為mRNA的富集奠定基礎。
　　 通過構建真核表達載體pPIC3.

3、5K-Xrn1，重組載體經SalⅠ線性化后，電擊轉入畢赤酵母GS115，然后通過甲醇誘導實現了XRN1蛋白在畢赤酵母中的胞內表達。結果表明酵母胞內表達量組菌可以表達全長XRN1重組蛋白，經Western blotting鑒定其大小約為175kDa，與目的蛋白大小基本相符。用Bradford法可測純化濃縮后的真核蛋白酶液的濃度:活性檢測表明，此重組蛋白具有5'-3'核糖核酸酶活性。
　　 最后利用響應面法對畢赤酵母初始鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

4、進行優(yōu)化。首先應用Plackett-Burman(PB)設計法對影響XRN1蛋白表達的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行篩選，選取的8個相關因子為:酵母提取物、硫酸鈣、MgSO4·7H2O、甘油、硫酸鉀、磷酸、硫酸銨和氫氧化鉀。統(tǒng)計分析表明，影響XRN1蛋白表達的關鍵因子為酵母提取物、硫酸鎂和硫酸鉀。再進行最陡爬坡試驗逼近3個關鍵因素的最大響應區(qū)域的基礎上，采用Box-Behnken Design法對發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，其最佳條件為酵母提取物0.4