1、第一部分遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體卵母細胞異源表達載體的構建及其功能檢測 目的:構建遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體的卵母細胞異源表達載體，利用非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)進行電生理學研究，探討一遺傳性長QT綜合征家系患者攜帶的E505DHERG基因突變引起LQTS的機制。 方法:利用快速PCR定點突變技術，設計一對引物(包含預定的突變E505D)，通過PCR，擴增出含突變位點的質粒，然后轉

2、化到超級感受態(tài)細胞中，用堿裂解法抽提質粒，進行測序鑒定，得到HERG基因E505D突變體的卵母細胞異源表達載體；將野生型和突變型的HERG基因的卵母細胞異源表達載體線性化，然后在體外轉錄成cRNA，通過顯微注射注入爪蟾卵母細胞，然后利用雙電極電壓鉗技術記錄膜電流。 結果:在卵母細胞異源表達載體pGH19-HERG基礎上獲得了E505D突變體的卵母細胞異源表達載體。E505DHERG不能檢測到電流的表達。突變型E505DHERG和

3、野生型HERG共表達檢測到的峰電流的幅度比野生型HERG表達檢測到的峰電流的幅度小，二者差異具有顯著性(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達檢測到的尾電流的幅度比野生型HERG表達檢測到的尾電流的幅度小，二者差異具有顯著性(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達檢測到的電流的G-V曲線與野生型HERG表達檢測到的電流相比發(fā)生右移，二者V1/2有顯著性差異(p＜0.05)。突變型E505D

4、HERG和野生型HERG共表達組內(nèi)向整流程度顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達組穩(wěn)態(tài)激活顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。突變型E505DHERG和野生型HERG共表達組內(nèi)向整流斜率顯著低于野生型HERG組(p＜0.05)。 降低電流幅度和減少通道開放，使Ikr電流減弱，動作電位時程延長，導致LQTS。 第二部分遺傳性長QT綜合征HERG基因真核表達

5、載體的構建及其在HEK293細胞中的表達 目的:構建HERG基因的真核表達載體，并在人胚胎腎細胞(HEK293)中進行表達。 方法:先將pGH19-HERG通過限制性酶切得到HERGcDNA，將后者克隆至pEGFP-C1中，構建表達載體pEGFP-HERG；然后將pEGFP-HERG和pIRES2-EGFP分別用BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中，即構建了HERG基因的真

6、核表達載體pIRES2-EGFP-HERG。然后利用電穿孔法將pIRES2-EGFP-HERG轉染HEK293細胞。 結果:在卵母細胞異源表達載體pGH19-HERG基礎上，獲得了真核表達載體pIRES2-EGFP-HERG，并在HEK293細胞中成功進行了表達。 結論:我們在HERG基因卵母細胞異源表達載體的基礎上，首先構建了HERG基因的真核表達載體pIRES2-EGFP-HERG，利用電穿孔法將其轉染至HEK293

7、細胞中并成功地進行了表達，為下一步進行膜片鉗的研究奠定基礎。 第三部分遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體真核表達載體的構建及其在HEK293細胞中的表達 目的:構建遺傳性長QT綜合征HERG基因E505D突變體的真核表達載體，并在HEK293細胞中進行表達。 方法:在HERG基因真核表達載體pIRES2-EGFP-HERG和包含E505D突變點的卵母細胞異源表達載體pGH19-HERG(E5

8、05D)質?；A上，利用基因重組技術，將含有突變點的HERGcDNA基因片段克隆到pIRES2-EGFP-HERG中，并進行測序鑒定；構建了HERG基因E505D突變體的真核表達載體pIRES2-EGFP-HERG(E505D)，利用電穿孔法將其轉染至HEK293細胞，48h后將細胞置熒光顯微鏡下觀察拍照。 結果:在野生型HERG基因真核表達載體pIRES2-EGFP-HERG基礎上獲得了E505D突變體的真核表達載體pIRES