1、研究背景:骨骼肌是人體的重要組成部分,占到整個(gè)人體總重量的40％左右。它在運(yùn)動(dòng)、蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和能量代謝中起著重要的作用。為此,任何影響骨骼肌功能的病變都會(huì)嚴(yán)重影響人體正常機(jī)體功能。而骨骼肌萎縮作為骨骼肌病變的一種,常見(jiàn)于臨床上的許多非生理狀態(tài)下,如禁食、癌癥、糖尿病、敗血癥和慢性腎衰等等。不同因?yàn)樗录∪馕s的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸在肌肉宏觀形態(tài)和功能上表現(xiàn)大同小異,其微觀分子機(jī)制研究在近年來(lái)取得了豐富成果。哥本哈根大學(xué)的研究人員在電鏡下觀察到去神經(jīng)

2、比目魚(yú)肌出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、核固縮、核周池?cái)U(kuò)大、染色質(zhì)濃縮等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變,但未發(fā)現(xiàn)明顯核碎片。Tews則比較肯定地認(rèn)為失去神經(jīng)支配后的肌肉存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。他采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT2mediated dU TP nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)了切斷神經(jīng)的大鼠面肌,發(fā)現(xiàn)失去神經(jīng)支配后大鼠面肌細(xì)胞出現(xiàn)DNA碎片?？梢?jiàn),細(xì)胞凋亡可能在骨骼肌萎縮和退化中發(fā)揮極其重要的作用。所以,保護(hù)骨骼肌細(xì)胞

3、的功能,防止和延緩骨骼肌細(xì)胞的凋亡對(duì)于對(duì)抗骨骼肌的萎縮極其關(guān)鍵。顯然抑制骨骼肌細(xì)胞的凋亡將是預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的重點(diǎn)之一。以往針對(duì)骨骼肌萎縮的治療進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn),主要有運(yùn)動(dòng)及功能訓(xùn)練、電刺激、成肌細(xì)胞移植、藥物治療包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、重組人生長(zhǎng)激素等有一定的療效,但是還沒(méi)有一種理想的方法可推廣應(yīng)用于臨床。因此,探索出一種理想的保護(hù)肌肉萎縮的治療策略有著極其重要的意義。我們認(rèn)為人參皂苷有可能成為有效治療這一疾病的

4、理想藥物。本課題將研究人參皂苷Rg1對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞的凋亡保護(hù)作用,從而間接的證明人參皂苷Rg1對(duì)抗骨骼肌萎縮的作用。
　　 目的
　　 1.探討人參皂苷Rg1對(duì)無(wú)血清誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　 2.探討人參皂苷Rg1對(duì)無(wú)血清誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 3.為臨床治療與骨骼肌凋亡相關(guān)的疾病提供一個(gè)新的探索途徑。
　　 方法

5、r>　　 1.將C2C12成肌細(xì)胞接種在25cm2培養(yǎng)瓶中普通傳代培養(yǎng),培養(yǎng)一段時(shí)間后將10％的FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞48h后,建立細(xì)胞凋亡模型。
　　 2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,將10％的FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換成終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L人參皂苷Rg1無(wú)血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后,利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化情況,Hoechs

6、t33258-PI熒光雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化,RT-PCR分析檢測(cè)促凋亡基因Caspase-3、AIF、Bax mRNA以及凋亡保護(hù)基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)差異性。
　　 結(jié)果
　　 1.MTT結(jié)果分析與凋亡組相比較,5、10、20μmol/L人參皂苷Rg1組可以顯著增加細(xì)胞活力(P<0.05),其中10μmol/L人參皂苷Rg1組為最佳濃度組,與其他三組都有顯著差異性。
　　 2.Hoechst332

7、58-PI熒光雙染色無(wú)血清培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后細(xì)胞狀態(tài)明顯不良,而加入5、10、20μmol/L人參皂苷Rg1組中C2C12成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡比率明顯減少(P<0.05),其中10μmol/L Rg1組效果最顯著,說(shuō)明人參皂苷Rg1可以減少C2C12成肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 3.半定量RT-PCR分析在基因水平檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn),在無(wú)血清培養(yǎng)48h的C2C12成肌細(xì)胞中,促凋亡基因Caspase-3、AIF、Bax