1、背景和目的:
　　肌衛(wèi)星細胞是骨骼肌組織內(nèi)最主要的干細胞成分，它通過激活轉(zhuǎn)化為具有增殖分化能力的成肌細胞負責骨骼肌的生后生長和損傷后再生，是骨骼肌損傷再生和可塑性的主要細胞基礎。近幾年研究顯示細胞能量代謝在干細胞的自我更新、增殖分化中具有重要調(diào)控作用，肌衛(wèi)星細胞在增殖分化進程中也呈現(xiàn)了顯著的能量代謝模式的改變。腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)是細胞內(nèi)能量代謝的關鍵感受和調(diào)控分子，活化的AMPK一方面抑制消耗ATP的合成代謝途徑，同

2、時啟動產(chǎn)生ATP的細胞內(nèi)分解代謝，最終恢復或維持細胞能量代謝的平衡。本課題以AMPK為研究重點，首先觀察了激活AMPK對成肌細胞C2C12增殖分化及線粒體功能活性等性狀的影響，然后基于前期報道觀察了熱量限制對老年骨骼肌及肌衛(wèi)星細胞AMPK信號通路的調(diào)節(jié)。以深入闡明代謝因素參與干細胞功能調(diào)節(jié)的可能機制，探討AMPK信號途徑對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化潛能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)掘促進老年骨骼肌組織損傷再生的潛在分子靶位。
　　方法:
　　1

3、.C2C12細胞的培養(yǎng)
　　C2C12成肌細胞株購自美國ATCC公司，細胞生長培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為含2％馬血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱溫度37℃，CO2濃度5％。
　　2.二甲雙胍處理后C2C12細胞AMPK通路相關蛋白表達的檢測
　　C2C12細胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后，WB檢測p-AMPKα、AMPKα和S

4、IRT1蛋白表達變化。
　　3.誘導AMPK活化后C2C12細胞增殖能力的檢測
　　C2C12細胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CCK-8細胞增殖實驗分別檢測培養(yǎng)0h、24h、48h后細胞增殖狀態(tài)，流式細胞周期分別檢測培養(yǎng)24h和48h后細胞周期的變化，同時以5-乙炔基-2-脫氧尿昔(Edu)摻入實驗檢測培養(yǎng)48h后DNA合成情況。
　　4.誘導AMPK活化后C2C12細胞肌原性轉(zhuǎn)錄因子表達及

5、肌管形成的檢測
　　(1) C2C12細胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，WB分別檢測培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后細胞Pax7蛋白表達變化，Real-Time PCR分別檢測培養(yǎng)24h和48h后細胞MyoD mRNA表達變化。
　　(2) C2C12細胞首先在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長培養(yǎng)基中預處理48h，然后在分化培養(yǎng)基條件下誘導其分化，通過Real-Time PCR分別檢測誘

6、導24h、48h和72h后Myogenin mRNA的表達，同時以吉姆薩染色檢測誘導72h后肌管形成情況，計算肌管融合指數(shù)（含2個以上細胞核的肌管比例）。
　　5.誘導AMPK活化后C2C12細胞線粒體膜電位的檢測
　　C2C12細胞在含二甲雙胍（終濃度1mmo l/L）的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過流式細胞儀以JC-1線粒體膜電位探針分別檢測培養(yǎng)24h和48h后細胞線粒體膜電位變化，同時以四甲基羅丹明乙酯(TMRE)線粒體膜電位

7、探針于激光共聚焦顯微鏡下檢測培養(yǎng)24h后細胞線粒體膜電位變化。
　　6.誘導AMPK活化后C2C12細胞線粒體分布、生成以及PGC1α表達的檢測
　　C2C12細胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過Mito-Tracker Green探針標記細胞線粒體，然后通過激光共聚焦和流式分別檢測細胞線粒體分布及生成情況。同時以WB檢測細胞PGC1α蛋白表達變化，以Real-Time PCR分別檢測細胞PGC1

8、αmRNA表達變化。
　　7.熱量限制動物模型的建立
　　13月齡雄性C57BL/6小鼠30只，按照簡單隨機抽樣法分為兩組:自由進食組和40％熱量限制組，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，一只熱量限制小鼠一周進食量=自由進食組小鼠平均每只一周進食量×60％，平均分至每天，熱量限制12周。
　　8.熱量限制后小鼠骨骼肌AMPK通路相關蛋白表達的檢測
　　WB檢測熱量限制后小鼠脛前肌p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表達變

9、化。
　　9.熱量限制后小鼠骨骼肌線粒體形態(tài)的觀察以及PGC1α蛋白表達的檢測
　　透射電鏡觀察熱量限制后脛前肌線粒體形態(tài)的變化，分別計算線粒體的密度、長度及寬度，WB檢測脛前肌PGC1α蛋白表達變化。
　　10.熱量限制后小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞AMPK通路相關蛋白表達的檢測
　　肌衛(wèi)星細胞的分離通過膠原酶和中性蛋白酶消化，然后通過多重熒光標記進行流式分選，其中CD45-/CD11b-/Sca-1-/CXCR4+/C

10、D29+細胞為肌衛(wèi)星細胞;分選的細胞提取總蛋白，然后通過ELISA分別檢測p-AMPKα、SIRT1和PGC1α表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.C2C12細胞在二甲雙胍處理24h后，AMPKα的磷酸化水平即顯著升高(p＜0.05);SIRT1蛋白表達在處理組顯著上調(diào)，處理48h后與對照組差異最為明顯(p＜0.05)。
　　2.二甲雙胍誘導AMPK活化后，通過CCK-8實驗觀察顯示C2C12細胞增殖速度明顯減慢，OD45

11、0nm在48h時較對照組顯著下降(p＜0.01);同時細胞周期也表現(xiàn)出明顯變化，S期細胞比例隨處理時間不斷升高，48h時較對照組差異顯著(p＜0.05)，而G2/M期細胞比例則不斷減少;DNA合成檢測結(jié)果顯示，Edu陽性細胞比例在二甲雙胍處理48h后與對照組相比增加明顯(p＜0.01)。
　　3.二甲雙胍處理24h后，C2C12細胞Pax7蛋白表達較對照組顯著升高(p＜0.01)，并在此后的處理期間一直維持較高表達水平;MyoD

12、mRNA表達在處理48h后，與對照組相比下降明顯(p＜0.01);C2C12細胞通過二甲雙胍預處理后，分化條件下Myogenin mRNA的表達在各檢測點均較低，誘導72h后，Myogenin mRNA表達和肌管融合指數(shù)較對照組均顯著下降（均為p＜0.01）。
　　4.通過兩種不同線粒體膜電位探針檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍處理24h后C2C12細胞線粒體膜電位較對照組下降明顯（均為p＜0.01）。
　　5.Mito-Tracke

13、r Green標記檢查結(jié)果可以明顯的觀察到二甲雙胍處理48h后C2C12細胞線粒體趨向核周聚集分布，同時線粒體平均熒光強度較對照組顯著升高(p＜0.01);蛋白及mRNA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，C2C12細胞在二甲雙胍處理24h后PGC1α蛋白表達和mRNA表達均顯著升高（分別為p＜0.01和p＜0.05）。
　　6.與對照組相比，熱量限制小鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平顯著上調(diào)(p＜0.01)，SIRT1蛋白表達也明顯升高(p

14、＜0.01)。
　　7.與對照組相比，熱量限制鼠骨骼肌線粒體密度明顯升高(p＜0.01)，體積明顯增大（長度:p＜0.05，寬度:p＜0.01）;同時PGC1α蛋白表達也顯著上調(diào)(p＜0.05)。
　　8.熱量限制鼠肌衛(wèi)星細胞p-AMPKα、SIRT1以及PGC1α表達較對照組均明顯升高（分別為p＜0.01; p＜0.05; p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.二甲雙胍能夠激活C2C12細胞AMPK信號通路，促

15、進其下游去乙?；窼IRT1等蛋白表達的上調(diào)。
　　2.二甲雙胍能夠抑制C2C12細胞增殖，使其細胞周期阻滯于S期;同時能夠上調(diào)Pax7蛋白的表達，下調(diào)MyoD基因的轉(zhuǎn)錄水平，在分化培養(yǎng)基誘導條件下抑制其定向分化，從而維持C2C12細胞的低分化狀態(tài)。這些影響可能依賴于二甲雙胍處理后C2C12細胞內(nèi)AMPK通路的活化及其相關蛋白表達的上調(diào)。
　　3.通過二甲雙胍激活AMPK能夠引起C2C12細胞線粒體膜電位的下降，提示細胞能量