1、目的:對本實驗室從疑似犬細小病毒感染的發(fā)病犬糞便中分離的病毒進行全面鑒定和分型;完成分離毒株的全基因組測序,分析進化變異情況;研究細胞傳代過程中分離毒株生物學(xué)特性變化和VP2基因的變異關(guān)系,為疫苗的研究提供依據(jù)。
　　 方法:采用同步培養(yǎng)法接種貓腎細胞(CRFK)增殖病毒,通過PCR試驗、HA試驗、HI試驗、IFA試驗、電鏡觀察、動物同歸試驗和VP2基因測序分析進行病毒的鑒定和分型;通過對分離毒株全基因組測序,并利用DNAsta

2、r軟件和Web server Uses Mfold(Version3.2)軟件分析本毒株和細胞多次傳代獲得的CPV-N株基因組的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu),研究分離毒株的變異情況。將病毒在CRFK細胞上連續(xù)傳代,對發(fā)生典型特征變化的代次進行VP2基因擴增和測序分析,推測VP2氨基酸殘基的非同義置換和病毒相關(guān)生物學(xué)特性改變的關(guān)系。
　　 結(jié)果:經(jīng)鑒定本實驗室分離的病毒為犬細小病毒強毒株,命名為CPV-DD株。對分離毒株進行PCR擴增,可擴

3、增出特異性DNA片段(1163bp);盲傳至第3代時,HA效價為1:8,其血凝性能被特異性抗體抑制;IFA可見特異性亮綠色熒光,TCID50為103.0/0.1mL;電鏡觀察可見20nm左右的病毒顆粒,動物回歸試驗表明CPV-DD株F3對犬的致死率為100％,在CRFK細胞傳至第18代時,失去對犬的致病力。病毒VP2蛋白序列分析顯示該毒株為CPV-2a型,其氨基酸序列在324位出現(xiàn)Try→Ile替換,處于VP2蛋白的潛在抗原表位。

4、>　　 病毒的全基因組測序結(jié)果顯示CPV-DD株F33’-UTR僅有一個重復(fù)序列,而F18和CPV-N株均有3個重復(fù)序列。CPV-DD株F18和CPV-N株的3’-UTR和VP1基因5’端的二級結(jié)構(gòu)較為相似,而CPV-DD株F3和前兩者有較大差異。推測CPV-DD株在細胞傳代過程中發(fā)生的這種改變可能與病毒適應(yīng)細胞有關(guān)。
　　 CPV-DD株在CRFK細胞上共傳至第33代,對發(fā)生典型生物學(xué)特征變化代次的VP2基因進行測序分析,其