1、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate，PFOS)是全氟有機化合物家族中的代表性化合物之一，在環(huán)境中無所不在，在野生動物和人類體內均發(fā)現(xiàn)有PFOS前體物和鹽類物。該化合物化學性質穩(wěn)定，在人體內的半衰期長，不易被代謝，可引起各類組織毒性，直接關系到人類健康問題。近年來國內外關于PFOS毒性研究主要集中在PFOS對實驗動物和人類可能造成的發(fā)育毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性、心血管毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PFOS在肝

2、臟中含量最多，故目前關于PFOS引起的肝臟毒性研究較為深入，且多篇研究報道已闡明PFOS致肝臟毒性作用機制主要與激活PPARα受體相關。而PFOS在心臟的生物累積含量僅次于肝臟，心臟又是胚胎發(fā)育最早形成的器官，已有報道在胚胎早期暴露烷基磺酸類毒性化合物極易致心臟發(fā)育損傷甚至畸形，如斑馬魚與PFOS共孵育后可引起靜脈竇和動脈球的距離增加、心率改變、孵化率下降等現(xiàn)象。雖然研究者掌握了一些關于PFOS在心臟發(fā)育領域毒性研究資料，但仍處于初始階

3、段，其引起的心臟毒性作用機制和敏感指標尚未完全闡明，因此，亟待深入探索PFOS致心臟發(fā)育毒性作用機制。
　　小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)細胞自首次從小鼠胚囊內層細胞中發(fā)現(xiàn)后，因其在體外具有分化全能性及自我更新等特點而在各種研究中得到廣泛應用。小鼠ES細胞定向分化成的心肌細胞不但具備心肌細胞表型，表達心肌特異性標志物，也具有心肌細胞正常的收縮-偶聯(lián)功能，基本模擬體內心肌細胞分化的過程，該模型已用于化合物致胚胎毒性

4、評價和研究。本課題組前期利用SILAC標記蛋白質組學技術研究了PFOS致小鼠ES細胞定向心肌細胞分化毒性差異蛋白表達譜，結果發(fā)現(xiàn)PFOS處理組和DMSO對照組比較共有176個差異蛋白。有28.8％差異蛋白參與了給生物體提供能量和物質的代謝過程，包括糖類代謝(4.5％)、核酸代謝(18.7％)、脂質代謝(5.6％)等。通過細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，差異表達蛋白定位在線粒體占11.4％，僅次于細胞核，推測PFOS致心肌細胞分化發(fā)育毒性作用的主要原因

5、之一與線粒體功能損傷相關。
　　線粒體是細胞合成ATP的重要場所，產(chǎn)生的能量用以維持細胞正常生理功能，參與胞內Ca2+調節(jié)和代謝等多種細胞活動。與其他類型細胞相比，心肌細胞對能量需求更高，線粒體更豐富，用以維持其正常新陳代謝及收縮活動，因此，心肌細胞對外源性化合物導致的線粒體損傷極其敏感。而線粒體依賴性能量通路不僅是啟動心肌分化的關鍵調控者，也是心肌再生作用的重要靶點，促進該環(huán)節(jié)可誘導ES細胞定向分化為心肌細胞，而抑制該環(huán)節(jié)則可導

6、致心肌分化受阻。線粒體和內質網(wǎng)之間存在相互偶聯(lián)，這種結構被命名為線粒體內質網(wǎng)偶聯(lián)結構(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)，該結構中起連接作用的主要是線粒體融合蛋白Mfn2和分子伴侶Grp75，其中Mfn2主要通過與Mfn1或Mfn2形成二聚體，而Grp75連接內質網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3 Receptor，IP3R)和位

7、于線粒體外膜的孔蛋白VDAC偶聯(lián)形成連接復合物，在線粒體和內質網(wǎng)之間構成連接，以保證Ca2+信號及脂質在線粒體和內質網(wǎng)之間的傳遞，線粒體Ca2+主要影響呼吸鏈中幾種脫氫酶，一定濃度可促進ATP合成。此外線粒體損傷時，線粒體融合蛋白Mfn2表達減少，導致線粒體膜電位降低。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mammalian target of rapamycin complex2，mTORC2)是由雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Rictor、

8、mLST8、PRR5和mSin1組成，近年研究發(fā)現(xiàn)該復合物存在于線粒體內質網(wǎng)偶聯(lián)結構中，其中Rictor是mTORC2特異性成分，是其發(fā)揮生物學作用必不可少的部分，Rictor可最大化激活p-Akt(ser473)并對Akt下游信號傳導起關鍵作用。研究表明在Rictor敲除的MEF細胞中IP3R磷酸化明顯減少，IP3R存在Akt結合位點，且mTORC2-Akt通過結合IP3R抑制肌漿網(wǎng)Ca2+釋放至線粒體。mTORC2缺失會破壞線粒體-

9、內質網(wǎng)結構偶聯(lián)，造成線粒體缺陷。ES細胞定向分化為心肌細胞過程中，伴隨著線粒體結構和功能逐漸成熟，存在能量轉換，表現(xiàn)為無氧糖酵解代謝向高效的線粒體有氧代謝轉換，以保證心肌細胞分化及心肌細胞正常興奮-收縮偶聯(lián)特征。若心肌細胞線粒體能量代謝發(fā)生障礙，如線粒體脂肪酸氧化能力降低，可造成脂肪酸堆積，乳酸產(chǎn)量增加，ATP產(chǎn)量減少，進而導致興奮收縮功能及Ca2+轉運功能等降低，最終誘發(fā)心力衰竭等心臟疾病。已有研究報道PFOS可導致成年大鼠線粒體損傷

10、，主要與其下調線粒體內ATP合酶表達相關，但迄今為止尚未見利用ES細胞體外定向心肌細胞分化模型，闡明PFOS致心肌細胞分化發(fā)育時線粒體損傷機制與線粒體內質網(wǎng)偶聯(lián)結構中若干分子事件的相關性。
　　表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長因子受體家族之一，主要參與調控細胞的增殖和分化，EGFR信號通路在胚胎發(fā)育期起著重要作用。已有文獻報道產(chǎn)前SD大鼠暴露PFOS引起新生斷

11、奶SD鼠心臟功能損傷與EGFR表達上調相關，EGFR與配體結合會促進EGFR酪氨酸的自磷酸化，而p-EGFR(Tyr1086)可激活Rictor/mTORC2活性，引起級聯(lián)信號反應。Rictor/mTORC2通過激活Akt(Ser473)磷酸化，一方面可促進HK2結合到線粒體外膜上，從而促進糖酵解通路，乳酸產(chǎn)量增多，降低線粒體膜電位，另一方面通過增加SREBP1裂解，進而增加脂肪酸合成關鍵酶Acaca和FASN的表達，最終造成細胞內脂肪

12、酸堆積，進一步損傷線粒體。關于PFOS是否通過增加p-EGFR激活Rictor/mTORC2信號，進而影響心肌細胞線粒體內質網(wǎng)間Ca2+穿梭，改變能量代謝，從而造成線粒體損失的研究尚未報道。
　　因此，本研究主要基于PFOS致小鼠ES細胞定向心肌細胞分化毒性作用差異蛋白表達譜結果，進一步探索PFOS對心肌細胞分化發(fā)育中線粒體損傷作用及相關機制，旨在闡明PFOS是否通過影響線粒體內質網(wǎng)偶聯(lián)結構中相關分子事件，干預Ca2+穿梭運動和線

13、粒體能量代謝過程，深入揭示PFOS對機體重要組織的毒性作用敏感靶點，同時有利于將EST作為一種有效的毒性靶點評價體系在化合物成藥性或環(huán)境毒物對心臟毒性預測性評估中的推廣應用，提供較高科學價值的實驗依據(jù)。
　　目的:
　　探索PFOS對小鼠ES細胞定向心肌細胞分化發(fā)育中線粒體損傷作用及相關機制，為深入揭示PFOS對機體重要組織的毒性作用敏感靶點提供實驗依據(jù)。
　　實驗方法:
　　采用經(jīng)典的“懸滴培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)-貼壁

14、培養(yǎng)”三步法建立小鼠ES細胞定向心肌細胞分化模型，檢測PFOS對小鼠ES細胞定向分化為搏動心肌細胞團分化率的影響，并運用免疫印跡技術、流式細胞術和免疫熒光染色法檢測心肌細胞定向分化過程中ES細胞全能性標志蛋白Oct4、中胚層特異性標記蛋白brachyury、心肌細胞特異性蛋白水平α-Actinin和肌球蛋白重鏈MYH10、Ca2+通道相關蛋白（L-typeCa2+ channel、RyR2）表達，心肌細胞數(shù)量及心肌肌小節(jié)成熟結構的形成情

15、況。采用活細胞工作站測定分化來的心肌細胞內質網(wǎng)Ca2+瞬變、線粒體Ca2+瞬變及胞內Ca2+濃度。采用ATP試劑盒檢測PFOS作用后的小鼠ES衍生心肌細胞(Embryonicstem cell-derived cardiomyocytes，ESC-CMs) ATP產(chǎn)量。JC-1染色考察PFOS作用對ESC-CMs線粒體膜電位的影響，并采用電鏡觀察線粒體結構。利用免疫印跡技術法檢測PFOS對凋亡調節(jié)蛋白Bax/Bcl-2比值的影響。檢測P

16、FOS作用后ESC-CMs的乳酸產(chǎn)量，及采用薄層色譜法檢測細胞內脂肪酸的含量。利用免疫印跡技術法檢測PFOS對線粒體功能相關蛋白PGC-1α、Mfn1及Mfn2，同時采用免疫共沉淀檢測PFOS作用后對MAM結構中IP3R-Grp75-VDAC復合體及IP3R-Akt結合的影響，利用免疫印跡技術法檢測PFOS對Rictor及其上游p-EGFR(Tyr1086)和其下游效應器Akt(Ser473)磷酸化表達影響，同時檢測了mTORC2信號通

17、路中參與線粒體損傷的相關蛋白HK2、SREBP-1裂解態(tài)，F(xiàn)ASN和Acaca的表達情況。
　　實驗結果:
　　1.40μM PFOS作用小鼠ES細胞后，抑制其定向心肌細胞分化，在分化day5+3、day5+4和day5+5時，心肌細胞分化率分別為18±7％、29±6％和42±5％，較DMSO溶劑對照組均顯著性降低（44±10％、60±3％和79±3％）。PFOS使ES細胞全能性標志蛋白Oct4表達在分化過程中下降受阻，同時

18、中胚層特異性標記蛋白brachyury、肌小節(jié)結構蛋白α-Actinin和肌球蛋白重鏈MYH10的表達均呈現(xiàn)顯著性下降。流式細胞術檢測結果顯示，PFOS作用后降低α-Actinin陽性表達的心肌細胞數(shù)。免疫熒光結果顯示，PFOS組分化而來的心肌細胞肌小節(jié)結構紊亂。提示PFOS可抑制小鼠ES細胞定向心肌細胞分化，使分化的心肌細胞數(shù)量減少、心肌特異性蛋白表達下降及心肌細胞肌小節(jié)結構紊亂。PFOS顯著降低ESC-CMs內咖啡因刺激后Ca2+瞬

19、變幅度及胞內[Ca2+]i，Western-blot結果顯示，PFOS組L-型Ca2+通道蛋白表達明顯降低，而RyR2蛋白表達水平無明顯差異，提示PFOS可能通過調節(jié)L-型Ca2+通道蛋白抑制心肌分化，改變RyR受體活性從而降低咖啡因介導的Ca2+瞬變。
　　2.PFOS作用后ESC-CMs的ATP產(chǎn)量顯著降低，細胞內線粒體膜電位降低，電鏡結果顯示PFOS組小鼠ES細胞衍生心肌細胞線粒體內嵴腫脹，甚至形成空泡，內嵴難以觀察，完整的

20、MAM結構減少，而對照組線粒體內嵴光滑、排列整齊，MAM結構完整。此外，免疫熒光結果也顯示PFOS組線粒體與內質網(wǎng)的重疊較對照組減少。Western blot結果顯示，PFOS作用后，兩組的凋亡調節(jié)蛋白Bax/Bcl-2比值及線粒體細胞色素C的含量均無明顯差異。乳酸產(chǎn)量檢測結果顯示，在day5、day5+5的擬胚體(Embryoid bodies，EBs)和ESC-CMs，PFOS組乳酸產(chǎn)量分別是0.46±0.12、0.33±0.02和

21、0.17±0.04 mmol/gprot，較溶劑對照組0.15±0.03、0.14±0.03和0.10±0.02mmol/gprot均顯著增加。薄層色譜法檢測PFOS作用后細胞內脂肪酸的含量也顯著上升。提示PFOS導致ESC-CMs的線粒體膜電位降低，線粒體內嵴腫脹，甚至空泡形成，MAM結構破壞，乳酸產(chǎn)量增加，造成脂肪酸堆積，ATP產(chǎn)量降低，但細胞色素C無溢出，且不引起細胞凋亡。
　　3.PFOS作用后顯著降低MAM結構中關鍵蛋白

22、Mfn2的表達，而Mfn1蛋白表達無明顯影響，IP3R-Grp75-VDAC復合體顯著減少，IP3R和Akt的結合顯著增加，同時PFOS顯著降低ESC-CMs內ATP刺激后線粒體Ca2+瞬變幅度，提示PFOS減少Ca2+從內質網(wǎng)向線粒體釋放可能與MAM結構破壞及Akt和IP3R結合增加相關。Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)PFOS增加了p-EGFR（Tyr1086）、Rictor及其下游效應器p-Akt(Ser473)蛋白的表達，且

23、PFOS組HK2在線粒體內的表達顯著高于溶劑對照組。同時，免疫熒光結果顯示PFOS作用后HK2與線粒體染料Mito的共表達與溶劑對照組相比明顯增加。PFOS組LDHA、裂解態(tài)SREBP-1，F(xiàn)ASN和Acaca表達顯著高于溶劑對照組，提示PFOS通過與EGFR作用，激活Rictor介導HK2結合至線粒體膜上，從而促進糖酵解通路。同時，Rictor通過促進SREBP-1裂解，進而增加細胞內脂肪酸合成，造成細胞內脂肪酸堆積;另一方面Rict

24、or信號分子促進SREBP-1裂解導致細胞內脂肪酸堆積，抑制PGC-1α表達，進而破壞MAM結構中關鍵蛋白Mfn2表達，同時增加Akt與IP3R受體結合，減少MAM結構中IP3R-Grp75-VDAC復合體形成，導致線粒體內質網(wǎng)Ca2+穿梭減少。
　　結論:
　　1.PFOS致ESC-CMs線粒體膜電位降低，ATP產(chǎn)量降低，線粒體內嵴腫脹，甚至空泡形成，MAM結構破壞，乳酸產(chǎn)量增加，造成脂肪酸堆積，但細胞色素C無溢出，且不引

25、起細胞凋亡。同時，PFOS顯著降低ESC-CMs內Ca2+濃度，降低RyRs受體介導的胞內Ca2+瞬變。
　　2.PFOS致心肌細胞線粒體損傷作用機制與促進EGFR磷酸化，激活Rictor信號分子介導HK2結合至線粒體膜上，促進糖酵解通路，提高乳酸產(chǎn)量，降低線粒體膜電位相關;另一方面激活的Rictor信號分子促進SREBP-1裂解導致細胞內脂肪酸堆積，抑制PGC-1α表達，進而破壞MAM結構中關鍵蛋白Mfn2表達，同時增加Akt與