1、鏈霉菌是微生物中產(chǎn)抗生素種類最多的種屬，目前世界上發(fā)現(xiàn)的5000多種抗生素中，60％以上是由鏈霉菌合成的。作為抗生素的生產(chǎn)菌，鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中有著悠久的歷史，隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，鏈霉菌的基因重組展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。自1980年首次報(bào)導(dǎo)鏈霉菌基因克隆以來(lái)，鏈霉菌基因工程日益興起。
　　 載體作為基因工程的重要工具是鏈霉菌基因工程首先遇到的問題。最初科學(xué)家們根據(jù)對(duì)少數(shù)幾種鏈霉菌遺傳背景已有的認(rèn)識(shí)，建立了一系列由其質(zhì)粒和噬菌

2、體衍生的克隆型載體。后來(lái)為了研究某些鏈霉菌基因的功能，需將其基因克隆至大腸桿菌中表達(dá)或修飾，有的甚至還需再轉(zhuǎn)移到模式鏈霉菌株（如天藍(lán)色鏈霉菌和變鉛青鏈霉菌）中做進(jìn)一步研究，于是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室紛紛開始構(gòu)建大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型載體。隨著鏈霉菌遺傳工程的進(jìn)一步發(fā)展，其對(duì)載體的要求越來(lái)越高，各種功能不同的載體相繼誕生，如鏈霉菌粘粒載體、鏈霉菌基因定域置換型克隆載體等。
　　 與此同時(shí)鏈霉菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也開始建立，主要有PEG介導(dǎo)或脂質(zhì)體協(xié)助的

3、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，以及電擊轉(zhuǎn)化法等。但由于鏈霉菌特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得這些轉(zhuǎn)化方法在實(shí)際應(yīng)用中遇到不少障礙，效率比較低。1987年，Trien-Cuot等首次闡明大腸桿菌與許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌之間可進(jìn)行質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上，Mazodier發(fā)展了質(zhì)粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的方法，即向大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體上引入接合轉(zhuǎn)移順式作用元件oriT，將其轉(zhuǎn)化到攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌中，載體就在RP4上的反式作用元件tra的誘

4、導(dǎo)下由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移到鏈霉菌中去，這種方法不但易于操作，而且可避開鏈霉菌的甲基化限制作用，提高外源基因的存活率。
　　 已有報(bào)導(dǎo)，重組質(zhì)粒在鏈霉菌中不能穩(wěn)定性存在，即使是通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的也不例外。人們就嘗試構(gòu)建一種可整合至鏈霉菌基因組的載體，主要由Streptomycesambofaciens的質(zhì)粒pSAM2改造和鏈霉菌噬菌體(Ψ)C31衍生得到。其中噬菌體(Ψ)C31的衍生載體因有較高的轉(zhuǎn)化效率而頗受偏愛，如pSET152

5、就是由其整合系統(tǒng)衍生而來(lái)，即在載體上引入attP序列(phageattachmentsite)和整合酶基因(int)，整合酶可介導(dǎo)attP與鏈霉菌基因組內(nèi)的attB(bacterialattachmentsite)間位點(diǎn)特異性重組，從而將整個(gè)載體包括外源基因整合進(jìn)鏈霉菌基因組中，使外源基因在沒有選擇壓力的情況下在鏈霉菌中穩(wěn)定存在。
　　 以上問題解決后，鏈霉菌的基因工程一直平穩(wěn)進(jìn)行著，但隨著研究的深入新的難題不斷涌現(xiàn)。鏈霉菌基因

6、組測(cè)序完成后人們發(fā)現(xiàn)，在鏈霉菌基因組中與某一天然產(chǎn)物生物合成途徑相關(guān)的基因往往成簇存在，因此都比較大(＞60kb)，要想完整地克隆這些基因簇就必須要有能裝載大片段的載體。目前應(yīng)用較廣的大片段克隆載體有酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌人工染色體(BAC)，BAC的插入片段不如YAC長(zhǎng)，但其有很多優(yōu)點(diǎn)可彌補(bǔ)YAC的不足，這就使得其應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了YAC?，F(xiàn)有的BAC載體多以大腸桿菌為宿主，缺乏在鏈霉菌中進(jìn)行基因操作的元件，使得其在鏈霉菌基

7、因工程中的應(yīng)用受到很大限制。
　　 本實(shí)驗(yàn)從原始載體pBeloBAC11出發(fā)，將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉(zhuǎn)移(oriT)、定點(diǎn)整合(attp-int)和安普霉素抗性篩選(Am)的oriT-attp-int-Am的DNA片段（稱之為替換盒），為了精確替換，實(shí)驗(yàn)采用了Red同源重組的方法，即將一段兩端與染色體（或載體）特定靶序列兩翼各有40～60bp同源序列的PCR線性DNA片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，利用λ噬菌體Red重組酶使該

8、線性片段與靶序列發(fā)生同源重組，線性DNA片段即可替換靶序列，得到的質(zhì)粒命名為pBTIBAC1。其中Red重組酶由輔助質(zhì)粒pKD46攜帶，其表達(dá)受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，且具有溫度敏感型的復(fù)制子，在溫度高于37℃時(shí)，自動(dòng)從宿主茵中清除。
　　 為便于以后使用，合成新的多克隆位點(diǎn)(MCS)，其上包含EcoRⅠ、AvrⅡ、PacⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)，通過(guò)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切插入到pBTIBAC1的相應(yīng)位點(diǎn)，得到最

9、終載體pBTIBAC11。
　　 接下來(lái)是對(duì)pBTIBAC11功能的驗(yàn)證。先檢驗(yàn)其是否具有接合轉(zhuǎn)移和整合的功能，在其多克隆位點(diǎn)反向插入鏈霉菌的組成型啟動(dòng)子ermEp*和綠色熒光蛋白基因（gfp），得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ET12567(pUZ8002)(接合轉(zhuǎn)移供體菌)，再通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至變鉛青鏈霉菌中，通過(guò)多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀（酶標(biāo)儀）和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果都顯示了綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明載體pBTIBAC11具有預(yù)期接合轉(zhuǎn)移

10、和整合的功能。
　　 然后檢測(cè)其裝載量。為了獲得足夠大的插入片段，采用了構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法，將變鉛青鏈霉菌TK24(Streptomyces'lividansTK24)的基因組做BamHⅠ的部分酶切，然后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，切取48.5-194.0kb的膠條進(jìn)行第二次脈沖場(chǎng)凝膠電泳，電洗脫回收條帶較亮部分，連入pBTIBAC11的相應(yīng)位點(diǎn)，電轉(zhuǎn)至DH10B中，對(duì)通過(guò)安普抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化子克隆提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ短

11、暫酶切鑒定插入片段的大小，平均都在100kb左右。
　　 綜上，本實(shí)驗(yàn)從原始載體pBeloBAC11出發(fā):①引入oriT序列，方便其由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌中，克服了鏈霉菌難于轉(zhuǎn)化和鏈霉菌嚴(yán)格限制系統(tǒng)的問題;②加入attp-int元件，可使外源基因（簇）連同載體一起整合至鏈霉菌基因組中，提高了外源基因（簇）的穩(wěn)定性;③替換了氯霉素抗性為安普霉素抗性，可用于載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和鏈霉菌的特異性篩選標(biāo)記;④保留了BAC載體原有的功能元