1、脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一種重要的工業(yè)酶類，廣泛應(yīng)用于食品、油脂化工、制藥和有機合成工業(yè)中，酶催化的反應(yīng)具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質(zhì)量高等優(yōu)點，具有巨大的應(yīng)用潛力。本實驗室培育的亞羅解脂假絲酵母Candidasp.99-125所生產(chǎn)的胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)活性高、催化活性強，已經(jīng)被成功應(yīng)用于油脂改性、多元醇酯合成、手性化合物拆分和可替代能源（生物柴油）合成等等，是工業(yè)生產(chǎn)中重要的催化劑。為了進

2、一步促進和拓展假絲酵母脂肪酶YlLip2的商業(yè)化應(yīng)用和生產(chǎn)，本文主要進行了如下工作:
　　 1、研究了固定化假絲酵母脂肪酶YlLip2用于外消旋α-苯乙胺的動力學(xué)拆分。本實驗中，本文首次利用了含有機助劑的介質(zhì)作為脂肪酶催化外消旋α-苯乙胺發(fā)生選擇性?；磻?yīng)的體系，實現(xiàn)了外消旋α-苯乙胺兩種對映體的拆分。在動力學(xué)拆分的過程中，脂肪酶YlLip2具有R型對映體優(yōu)先選擇性且對映體過量值由于3％(v/v)極性有機助劑DMSO的加入得到

3、了顯著增長，對映體過量值(e.e.p)由0.35增長到了0.96，對映體比率(E)提高約20倍，最終達到190;而E值大于50一般即認為具有工業(yè)應(yīng)用價值。這是該酶首次應(yīng)用于手性胺類的拆分。
　　 2、由于芽孢桿菌具有高效、功能性表達外源蛋白的優(yōu)勢，本文研究了假絲酵母脂肪酶YlLip2在枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）體系中的重組表達策略。首先，構(gòu)建了基于游離型質(zhì)粒的表達平臺。通過分離、克隆了多個枯草芽胞桿菌內(nèi)的表

4、達元件，包括組成型啟動子（PdegQ、PglpD和PaprE）和誘導(dǎo)型啟動子(PamyE、PsacB)，以及α-淀粉酶的信號肽和終止子序列，構(gòu)建了一系列新的分泌型表達質(zhì)粒。質(zhì)粒中插入脂肪酶基因YlLip2后，轉(zhuǎn)化蛋白酶缺失型的枯草芽胞桿菌DL3p菌株，實現(xiàn)了重組脂肪酶的分泌性表達，胞外酶活表達水平達到0.2-4.5U/mg總蛋白。另一方面，本文研究并建立了一種新的枯草芽孢桿菌內(nèi)染色體整合方法。以全長的單鏈DNA為電轉(zhuǎn)化底物，利用枯草芽胞

5、桿菌自身的同源整合機制，實現(xiàn)了簡單、高效的在枯草芽孢桿菌染色體上進行外源基因的整合及目標基因的替換。以脂肪酶YlLip2為驗證對象，通過多重融合PCR構(gòu)建了兩端具有同源臂的融合蛋白表達框，并通過不對稱PCR、5’端硫代磷酸化修飾等手段制備了全長型的單鏈DNA表達框作為底物，電轉(zhuǎn)化后實現(xiàn)了該脂肪酶表達框在染色體上amyE位點的基因替換（即雙交換整合），且重組脂肪酶rYlLip2實現(xiàn)了功能性表達，酶活約為0.91U/mg總蛋白。該方法對枯草

6、芽孢桿菌內(nèi)重組蛋白表達、基因功能研究等都具有很大的意義。
　　 3、為了提高假絲酵母脂肪酶的表達水平，進一步降低其生產(chǎn)成本，本文研究了假絲酵母脂肪酶在巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）宿主中的高效表達。重組表達質(zhì)粒pPICZαA-Lip2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株后整合于染色體中，在100μg/mLZeocin平板上篩選得到的重組菌株＃0-8號經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，在5升發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)酶水平可達到4580U/mL發(fā)酵液，且發(fā)酵液

7、中rYlLip2的表達量達到1.05g/L發(fā)酵液，重組蛋白含量可以占到總蛋白的50％以上。為了進一步提高重組蛋白的表達水平，本文又對重組畢赤酵母進行了多拷貝子的篩選。在500μg/mLZeocin高抗生素濃度下成功篩選得到脂肪酶高產(chǎn)菌株#2-8號和#3-5號兩個多拷貝菌株，搖瓶產(chǎn)酶實驗證實#2-8號菌株胞外重組脂肪酶活性可達到350U/mL，與單拷貝子#0-8號菌相比提高了30％;而在5升發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液中酶活達到11000U/mL，與#

8、0-8號相比提高了150％。重組蛋白含量達到了2.3g/L發(fā)酵液，時空產(chǎn)量達到67900U/L/h。由此，重組假絲酵母脂肪酶YlLip2的表達量得到了顯著提高，實現(xiàn)了重組脂肪酶的高水平表達。經(jīng)Southernblot印跡雜交分析確定脂肪酶高產(chǎn)菌株#2-8和#3-5為多拷貝轉(zhuǎn)化子，拷貝數(shù)約為3。
　　 4、亞羅解脂假絲酵母脂肪酶作為一種具有廣泛應(yīng)用價值的脂肪酶，其熱穩(wěn)定性卻較差，妨礙了該酶的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化。在本實驗中，我們以提高脂肪

9、酶YlLip2的熱穩(wěn)定性為目標，分別利用分子定向進化技術(shù)、半理性設(shè)計方法B-FIT對酶進行改造，獲得了多個熱穩(wěn)定性提高的突變酶，包括單點突變體F237C、A103S和T117G，將酶在50℃下的半衰期t1/2由2min提高至了5.5min。而后通過定點突變技術(shù)構(gòu)建了多位點組合突變體并進行了分析、鑒定。其中，熱穩(wěn)定性最高的組合突變體T117G/F237C在50℃下的半衰期達到14.4min，與原始酶相比提高了7倍以上。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬，