1、第一章人肝癌耐藥細胞株SMMC-7721/ADM的建立及其與人肝癌細胞株SMMC-7721及人正常肝細胞株LO2的miRNAs表達譜分析
　　目的
　　探討人肝癌耐藥細胞株SMMC-7721/ADM與其親本細胞SMMC-7721及人正常肝細胞株LO2的miRNAs的差異表達
　　方法
　　(1) MTT法測定阿霉素對SMMC-7721的IC50，以其為起始濃度及采用順濃度梯度法培養(yǎng)SMMC-7721，建立耐藥細胞

2、株SMMC-7721/ADM，繪制兩細胞株的生長曲線及計算倍增時間，MTT法測ADM對SMMC-7721/ADM的IC50及計算耐藥指數(shù)，westernblotting測定LO2，SMMC-7721及SMMC-7721/ADM的MDR1蛋白表達。
　　(2) miRNA芯片分析人肝癌細胞株SMMC-7721與SMMC-7721/ADM及人正常肝細胞株LO2中差異表達的miRNAs，并采用RT-PCR驗證芯片結果。
　　結果<

3、br>　　(1) ADM對SMMC-7721的IC50為0.12±0.01μg/ml，兩細胞株有相似的生長曲線，倍增時間無明顯差異(p＞0.05)，ADM對SMMC-7721/ADM的IC50為2.96±0.12μg/ml。耐藥指數(shù)為24.67。MDR1蛋白在SMMC-7721/ADM中表達高于其親本細胞SMMC-7721及LO2(p＜0.05)，SMMC-7721高于正常肝細胞株LO2(p＜0.05)。
　　(2)通過芯片篩選，

4、 LO2與SMMC-7721相比，上調(diào)2倍以上的miRNAs有189個，下調(diào)2倍以上的有246個。SMMC-7721與SMMC-7721/ADM上調(diào)2倍以上的有176個，下調(diào)2倍以上的有159個。SMMC-7721/ADM與LO2相比上調(diào)2倍的有160個，下調(diào)2倍的有134個。在LO2，SMMC-7721，SMMC-7721/ADM中表達差異兩倍以上且依次上調(diào)的有miR-1246，miR-3676-5p，miR-4443，依次下調(diào)的有m

5、iR-101-3p， miR-1469。RT-PCR驗證了miR-1246與miR-1469在LO2，SMMC-7721，SMMC-7721/ADM中的表達量，其結果與芯片相一致(p＞0.05)。
　　結論
　　(1)我們成功構建了SMMC-7721/ADM。
　　(2)通過對LO2，SMMC-7721，及SMMC-7721/ADM的miRNA芯片分析篩選出依次顯著上調(diào)的miR-1246， miR-3676-5p和mi

6、R-4443;和依次顯著下調(diào)的有miR-101-3p，miR-1469。并對miR-1246與miR-1469進行驗證，證明了芯片結果的可靠性。
　　第二章miR-1246在肝癌耐藥細胞株SMMC-7721/ADM的研究
　　目的：
　　探討miR-1246在人肝癌耐藥細胞株SMMC-7721/ADM中的作用研究
　　方法：
　　(1)設計及合成miR-1246 inhibitor片段，轉(zhuǎn)染至SMMC-77

7、21/ADM，RT-PCR測定SMMC-7721，SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組及SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組及中miR-1246的表達量。
　　(2)實驗分組:A組為SMMC-7721，B組為SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組，C組為SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組。
　　(3) MTT檢測三組細胞株的增殖能力，并測定ADM對SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組的IC50。
　　(4)FCM檢測三

8、組細胞株的細胞周期。
　　(5) FCM AV-PI檢測三組細胞株的細胞凋亡。
　　(6) Transwell檢測三組細胞株的遷移能力。
　　(7)鋪matrigel的Transwell檢測三組細胞株的侵襲能力。
　　結果：
　　(1)顯微熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率達到85％左右，目的轉(zhuǎn)染組miR-1246含量低于空白轉(zhuǎn)染組(p＜0.05)，與SMMC-7721無明顯差異(p＞0.05)。
　　(2)MTT

9、實驗結果顯示C組的增殖能力較A、B組下降(p＜0.05)，B組與A組無明顯差異(p＞0.05)。ADM對C組的IC50為0.08±0.01μg/ml。與SMMC-7721/ADM的IC50(2.96±0.12μg/ml)相比顯著下降(p＜0.01)，與SMMC-7721（0.12±0.01μg/ml）相比無明顯差異(p＞0.05)。
　　(3)細胞周期實驗示三組細胞株各周期之比無明顯差異(P＞0.05)
　　(4)細胞凋亡實

10、驗示C組與A、B組相比其凋亡率升高且有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，B組與A組無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(5)遷移能力實驗結果顯示C組的遷移能力低于B組(p＜0.05)，與A組則無明顯統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，B組遷移能力高于A組(p＜0.05)。
　　(6)侵襲實驗結果顯示C組的侵襲能力低于B組，與A組無明顯統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，B組侵襲能力高于A組(p＜0.05)。
　　結論：
　　(1)

11、在SMMC-7721/ADM中，通過與親本細胞SMMC-7721分析，細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡無明顯差異，而遷移侵襲能力明顯增強。提示miR-1246的上調(diào)可能參與SMMC-7721/ADM的侵襲遷移能力的提高。
　　(2)通過對轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor的SMMC-7721/ADM分析，細胞增殖能力降低，凋亡數(shù)增加。提示miR-1246的上調(diào)可增加耐藥肝癌細胞株的增殖能力，抑制凋亡，但對細胞周期無明顯影響;細胞

12、侵襲和遷移實驗的降低表明miR-1246的上調(diào)可提高耐藥肝癌細胞株的遷移與侵襲能力，轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor的SMMC-7721/ADM的48h IC50明顯下降，提示miR-1246的下調(diào)使ADM對SMMC-7721/ADM敏感性增加
　　第三章hsa-miR-1246的生物信息學分析及靶基因預測驗證
　　目的：
　　對has-miR-1246進行生物信息學分析及靶基因預測和在耐藥肝癌細胞株中的靶基因

13、驗證。
　　方法：
　　(1)通過TargetScan、miRanDa和miRDB三個靶基因預測網(wǎng)站，對其進行靶基因初步篩選，選擇3個網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫的交集基因行下一步預測研究。用DAVID數(shù)據(jù)庫對miR-1246的靶基因集合行GO注釋和KEGG的生物通路富集分析。
　　(2)確立在肝癌耐藥細胞株中的靶基因，并采用western-blotting及RT-PCR驗證。
　　結果：
　　(1) hsa-miR-124

14、6在TargetScan、miRanDa、 miRDB數(shù)據(jù)庫預測靶基因，其結果為TargetScan為178個，miRanDa為5983個，miRDB為398個，總共交集預測靶基因為57個。其中GSK3β，UNC5，SEMA6a參與KEGG通路為AXON GUIDANCE通路（Rho GTPase1家族通路）。
　　(2) GSK3β蛋白和mRNA表達在SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組均高于SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組