1、癌癥是威脅人類健康的一大難題，據(jù)預(yù)測，到2020年，全球每年癌癥新發(fā)病人數(shù)將達(dá)到1500萬。目前，世界上癌癥發(fā)病率以肺癌居首，依次為腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌等；我國的情況則是肺癌、胃癌、肝癌發(fā)病率排名前三。由于癌癥病死率高，發(fā)病率又與日俱增，所以越來越受到人們的重視。
　　 現(xiàn)在，癌癥的治療策略主要為手術(shù)和化療為主。化療藥物在臨床治療中廣泛使用，但是無一例外的，都受到機(jī)體耐藥性的產(chǎn)生以及藥物自身的毒副作用嚴(yán)重制約，所以如何提高化

2、療藥物的治療效益是很多臨床和科研工作者希望解決的問題。化療藥物種類繁多，阿霉素(adriamycm又稱doxorubicinhydrochloride)就是其中一種經(jīng)典抗生素類廣譜抗腫瘤化療藥物，它在急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及多種其他實(shí)體腫瘤均有治療作用；其抗腫瘤作用機(jī)制是不僅可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，致細(xì)胞變性壞死；也可影響拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性抑制DNA的合成，影響細(xì)胞周期；或者損傷DNA(damageDNA)，啟動(dòng)內(nèi)源和外源信號抑制

3、RNA合成，對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。近年，通過阿霉素對外周感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞毒性的研究，突破了阿霉素作為抗腫瘤藥物的傳統(tǒng)觀念，合理應(yīng)用阿霉素可以治療難治性神經(jīng)痛。
　　 Survivin基因是一個(gè)細(xì)胞凋亡抑制基因，其表達(dá)蛋白作為細(xì)胞凋亡蛋白抑制物(inhibitor-ofapoptosisprotein，IAP)家族新成員，可通過抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3活性或與周期蛋白激酶CDK4，CDK2相互作用阻斷凋亡信號通路參與細(xì)胞凋

4、亡，影響細(xì)胞周期。survivin基因的表達(dá)具有腫瘤特異性，表達(dá)于腫瘤及胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 NF-κB通路作為一條與炎癥關(guān)系較為密切的信號通路，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控200多個(gè)基因的表達(dá)。它的活化對細(xì)胞的抗凋亡與凋亡起著雙重作用。Caspase3是細(xì)胞Caspase級聯(lián)反應(yīng)中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，無論細(xì)胞外源性信號途徑激活Caspase8，或者內(nèi)源性信號途

5、徑激活Caspase12，還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑激活Caspase9，最終都將激活Caspase3進(jìn)一步作用于下游分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 基于上述研究背景，我們在前期的研究工作觀察到阿霉素對肺癌細(xì)胞株A549的增殖抑制作用中出現(xiàn)雙重效應(yīng)，也即阿霉素藥物濃度逐漸升高，細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)隨之增強(qiáng)，但當(dāng)藥物濃度達(dá)5μg/ml時(shí)隨著濃度繼續(xù)增加增殖抑制效應(yīng)卻出現(xiàn)減弱趨勢，這將對我們今后在阿霉素臨床應(yīng)用以及新藥效研究上有什么啟示?希望通過本課題

6、就這現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制研究得到可能的答案。
　　 第一部分，阿霉素對肺癌細(xì)胞株A549增殖抑制的雙重效應(yīng)
　　 阿霉素是一種經(jīng)典抗生素類廣譜抗腫瘤化療藥物，對多種腫瘤具有抑制增長的效應(yīng)，在臨床與科研實(shí)驗(yàn)中都有比較廣泛的應(yīng)用，且在各個(gè)環(huán)境下使用濃度也有所不同。至于不同藥物濃度作用下，阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)理是否完全一致迄今未見有關(guān)報(bào)道，尚需進(jìn)一步探討。在本部分研究中，我們主要采用了細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，也即MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度阿

7、霉素干預(yù)處理肺癌細(xì)胞株A549后的細(xì)胞增殖抑制。
　　 結(jié)果表明，以不同濃度阿霉素(0.1、0.2、0.5、1、2、5、12.5、25、50和100μg/ml)分別干預(yù)處理肺癌細(xì)胞株A549，時(shí)間24小時(shí)，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測到的各濃度對細(xì)胞增殖抑制率相比較空白對照組都具有顯著差異，其中IC50值為1μg/ml。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)藥物濃度在5μg/ml以下，隨濃度升高細(xì)胞增殖抑制率也增高，組間差異明顯(P<0.05)，

8、在濃度為5μg/ml時(shí)達(dá)最高值；藥物濃度在5μg/ml以上，隨濃度繼續(xù)升高細(xì)胞增殖抑制率隨之出現(xiàn)下降趨勢，分別與濃度5μg/ml組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這種阿霉素對肺癌細(xì)胞株A549增殖抑制雙重性效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制，尤其是否對阿霉素在臨床使用或新藥效研究中有重要價(jià)值，未見報(bào)道。為進(jìn)一步明確出現(xiàn)這種細(xì)胞增殖抑制雙重性現(xiàn)象不是由于細(xì)胞在阿霉素藥物作用下的變性壞死所為，我們選擇了5個(gè)具有顯著差異的濃度組；0.1、0.5、1、5和5

9、0μg/ml，其抑制率分別為11.1％、33.4％、48.5％、71.9％和57.5％，藥物濃度分布在出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制率最高值濃度5μg/ml的兩側(cè)。采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞變性壞死后LDH的釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各藥物濃度干預(yù)作用下LDH釋放水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。又經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，因此我們可以認(rèn)為，阿霉素對肺癌細(xì)胞株A549增殖抑制雙重效應(yīng)可能是通過對細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡的調(diào)控失衡所致，闡明其發(fā)生機(jī)制可能對阿霉素臨床使用或

10、新藥效研究有一定啟迪。
　　 第二部分，survivin和caspase3可能參與了這個(gè)雙重效應(yīng)
　　 Survivin基因作為細(xì)胞凋亡抑制基因，其表達(dá)產(chǎn)物survivin蛋白對細(xì)胞的存活有著重要意義。survivin基因的表達(dá)具有腫瘤特異性，其表達(dá)于腫瘤及胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；在細(xì)胞處于G0/G1期時(shí)，其表達(dá)是上調(diào)的，可能起到抗細(xì)胞凋亡作用。細(xì)胞在接受阿霉素干預(yù)處理后，會(huì)發(fā)生DNA損傷，啟

11、動(dòng)內(nèi)源性和外源性信號，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡以及抗凋亡途徑，caspase3作為細(xì)胞凋亡終未效應(yīng)酶，可能參與其中。為證實(shí)survivin基因表達(dá)與阿霉素呈現(xiàn)的細(xì)胞增殖抑制雙重效應(yīng)相關(guān)，本部分實(shí)驗(yàn)選擇抗細(xì)胞凋亡基因survivin、促細(xì)胞凋亡基因Bax以及細(xì)胞凋亡過程中的終未效應(yīng)酶Caspase3分子，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測其mRNA在不同濃度阿霉素干預(yù)處理肺癌細(xì)胞株A549后的表達(dá)水平。
　　 肺癌細(xì)胞株A549在選擇的5個(gè)不同濃

12、度阿霉素(0.1、0.5、1、5和50μg/ml)干預(yù)處理24小時(shí)后，survivin基因mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR相對值分別為0.71、0.32、0.84、1.11和5.73，可見在藥物濃度達(dá)50μg/ml時(shí)，該值顯著增加，伴隨caspase3基因的表達(dá)在同樣藥物濃度時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR值結(jié)果為2.09、6.23、14.70、4.17和0.21，在藥物濃度達(dá)到50μg/ml時(shí)該值卻顯著下降。survivin與caspase3在不同濃度阿

13、霉素干預(yù)處理8小時(shí)后，呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。這幫助我們解釋了阿霉素藥物濃度在高于5μg/ml時(shí)，由于細(xì)胞凋亡抑制基因survivin的表達(dá)水平大幅度上調(diào)，肺癌細(xì)胞株A549的增殖抑制率卻出現(xiàn)下降這一現(xiàn)象；同時(shí)也告之細(xì)胞凋亡參與阿霉素抗腫瘤作用。
　　 第三部分，細(xì)胞周期阻滯與這個(gè)雙重效應(yīng)可能相關(guān)
　　 研究報(bào)道survivin基因作為細(xì)胞凋亡抑制基因具有抗凋亡功能，其表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，但是survivin基因介

14、導(dǎo)的細(xì)胞周期抑制作用是否參與阿霉素對肺癌細(xì)胞株A549增殖抑制效應(yīng)尚未見報(bào)道。為此，本部分實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步證實(shí)，并探討其可能作用的細(xì)胞周期調(diào)控分子。本部分通過對5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(藥物濃度0.1、0.5、1、5和50μg/ml)作用細(xì)胞24小時(shí)后，western檢測其蛋白表達(dá)水平與survivin基因表達(dá)水平是否一致。通過流式細(xì)胞技術(shù)分析其細(xì)胞周期的變化，并且對周期阻滯蛋白P21表達(dá)的檢測，進(jìn)一步說明細(xì)胞周期是否對細(xì)胞增殖抑制產(chǎn)生影響。以及用羥基

15、脲抑制細(xì)胞周期至G1期后再進(jìn)行阿霉索處理，觀察細(xì)胞生長抑制狀況。
　　 研究結(jié)果表明，survivin蛋自在高濃度藥物作用下表達(dá)量明顯升高，與基因表達(dá)水平一致。從細(xì)胞周期檢測可以看到，藥物刺激組細(xì)胞表達(dá)基本阻滯在G1/S期以前，G1期細(xì)胞相對比例為(1.01、0.88、0.61、0.84、0.96)并且濃度1μg/ml組為最低值，高濃度組(50μg/ml)G1期細(xì)胞比例上升。進(jìn)一步對P21的western檢測發(fā)現(xiàn)，藥物刺激組的P

16、21表達(dá)水平都有顯著升高。說明在阿霉素作用后，A549細(xì)胞株發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞停留在G1/S，伴隨survivin基因的高表達(dá)，這種表達(dá)可能與G0/G1期細(xì)胞數(shù)目關(guān)系更為密切(線型一致)。進(jìn)一步使用羥基脲將細(xì)胞周期阻滯于G1期后，再用阿霉素進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)阿霉素整體作用效能下降，細(xì)胞各濃度組間差異不明顯。提示高濃度阿霉素作用于A549后，細(xì)胞發(fā)生周期阻滯于G1期，通過高表達(dá)的survivin促進(jìn)了細(xì)胞的存活。
　　 第四部分

17、，細(xì)胞凋亡水平變化可能參與了此雙重效應(yīng)
　　 阿霉素刺激細(xì)胞，導(dǎo)致DNA損傷，不可避免的帶來凋亡信號。與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號通路有很多，NF-κB作為其中的一條炎癥信號通路，參與細(xì)胞凋亡與抗凋亡的發(fā)生。本部分通過AnnexinV流式檢測觀察細(xì)胞凋亡早晚期情況以及westernblotting檢測caspase3蛋白表達(dá)情況和NF-κB激活狀態(tài)說明細(xì)胞凋亡水平與此雙重效應(yīng)相關(guān)
　　 通過流式觀察5個(gè)處理組隨著濃度的升高，

18、處于凋亡期的細(xì)胞比例分別為(7.5％(對照組)、13％、12.1％、14.7％、32.2％、18％)，說明在高濃度情況下(50μg/ml)，處于凋亡期的細(xì)胞確實(shí)相對減少。’Western檢測activatecaspase3在高濃度組(50μg/ml)無表達(dá)，低濃度組(0.5μg/ml)有表達(dá)，與基因水平一致，進(jìn)一步證實(shí)了與細(xì)胞凋亡相關(guān)。進(jìn)一步通過對磷酸化P65蛋白的檢測，我們可以看到，在阿霉素作用下，高濃度組(50μg/ml)和低濃度組