1、前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來我國前列腺癌發(fā)病率逐漸上升，前列腺癌目前多采用雄激素全阻斷為主的內(nèi)分泌治療，但多數(shù)病人在經(jīng)過內(nèi)分泌治療后，常常轉(zhuǎn)為非雄激素依賴性，成為激素難治性前列腺癌，出現(xiàn)復(fù)發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療和激素療法對(duì)激素難治性前列腺癌治療效果不佳，目前國內(nèi)外許多學(xué)者都在探求基因水平的調(diào)控方法和尋找治療的新靶點(diǎn)，以期在前列腺癌的治療上取得突破。 近年研究證明細(xì)胞膜鞘磷脂的衍生物包括神經(jīng)酰胺(

2、Cer)、鞘氨醇(Sp)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)等多種代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵的作用。而鞘氨醇激酶(SPK)是維持細(xì)胞內(nèi)上述物質(zhì)平衡的重要限速酶，也是細(xì)胞增殖及存活的重要調(diào)控因子。鞘氨醇激酶信號(hào)通路與細(xì)胞的凋亡、生長、增殖密切相關(guān)，SPK1是其主要功能酶。Cer和Sp是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，能夠抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，S1P則刺激細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡。SPK1磷酸化Sp生成S1P，S1P通過細(xì)胞內(nèi)外作用

3、機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡。對(duì)SPK1進(jìn)行調(diào)控，將影響細(xì)胞內(nèi)Cer、Sp、S1P的水平，細(xì)胞內(nèi)Cer、Sp、S1P的水平的高低，將影響細(xì)胞的生長、增殖和凋亡。 RNA干涉(RNAi)是近期發(fā)展起來的一種新的基因治療和診斷技術(shù)，RNA干涉是指在多種生物細(xì)胞內(nèi)，由雙鏈RNA介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象。我們?cè)O(shè)想通過RNA干涉的方法，導(dǎo)致SPK1基因沉默，進(jìn)而抑制SPK1的表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸

4、鞘氨醇在細(xì)胞內(nèi)的水平，誘導(dǎo)非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的凋亡，以探討對(duì)非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的基因治療。 目的：通過檢測(cè)SPK1信號(hào)分子在非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞Du145中的表達(dá)情況，以及評(píng)價(jià)重組腺病毒Ad-H1-SPK1介導(dǎo)，RNA干涉Du145細(xì)胞SPK1基因，對(duì)SPK1和抗凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)的影響；探討重組腺病毒Ad-H1-SPK1介導(dǎo)，干涉SPK1對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及可能的機(jī)制，為非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的基因治療尋找

5、新的靶點(diǎn)。 方法：我們選擇非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株Du145，作為我們的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象；構(gòu)建并制備了攜帶SPK1特異干涉序列的重組腺病毒Ad-H1-SPK1，作為介導(dǎo)對(duì)SPK1基因進(jìn)行RNA干涉的研究工具；我們利用RT-PCR的方法，檢測(cè)Du145細(xì)胞株中SPK1信號(hào)分子的表達(dá)；用腺病毒Ad-GFP作為參照，用不同滴度的腺病毒對(duì)Du145細(xì)胞進(jìn)行感染，檢測(cè)腺病毒對(duì)Du145的感染效率；我們用Ad-H1-SPK1感染Du-145細(xì)

6、胞，并以不含SPK1特異干涉序列腺病毒Ad-H1作為對(duì)照，Western blot檢測(cè)SPK1的表達(dá)，并用Western blot檢測(cè)重要抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)，評(píng)價(jià)干涉SPK1對(duì)SPK1、Mcl-1蛋白表達(dá)的影響；用MTT的方法檢測(cè)干涉SPK1，對(duì)阿霉素抑制前列腺癌細(xì)胞Du-145增殖的影響；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，評(píng)價(jià)干涉SPK1對(duì)喜樹堿誘導(dǎo)Du-145細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：我們用RT-PCR的方法，在非激素依

7、賴性前列腺癌細(xì)胞株Du-145中檢測(cè)到了SPK1信號(hào)分子的表達(dá)；我們測(cè)定腺病毒對(duì)Du-145細(xì)胞的感染效率為99.92％(MOI=100)，完全可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求；用Ad-H1-SPK1感染Du-145細(xì)胞，介導(dǎo)對(duì)SPK1進(jìn)行干涉，SPK1干涉后，SPK1、Mcl-1蛋白表達(dá)明顯受到抑制，Ad-H1一SPK1+阿霉素組細(xì)胞生存率低于對(duì)照Ad-H1+阿霉素組，48小時(shí)為對(duì)照組的71.2％，72小時(shí)為對(duì)照組的61.3％：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

8、Du145細(xì)胞的凋亡，Ad-H1-SPK1+喜樹堿組的平均細(xì)胞凋亡率58.3％，高于對(duì)照組Ad-H1+喜樹堿組29.1％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明，SPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞Du145的凋亡，靶向SPK1的RNA干擾可以抑制Du145細(xì)胞的SPK1以及重要抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)，增加阿霉素對(duì)Du145細(xì)胞增殖的抑制，增加喜樹堿誘導(dǎo)的Du145細(xì)胞的凋亡。SPK