1、目的：通過定點突變技術(shù)得到保守基序的各種突變體(p20l/a、p20s1/a、p20k/a、p20i/a、p20v1/a、p20v2/a)，并通過Westernblotting探討保守基序中各氨基酸對大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影響。 方法： 1、采用定點突變技術(shù)，設(shè)計相應(yīng)突變引物，以p20為模板，基于。PCR擴增得到突變體，并經(jīng)測序驗證。 2、用質(zhì)粒中量提取試劑盒得到足量的質(zhì)粒，然后利用陽離子脂質(zhì)體Lipof

2、ectAMINE將各突變體及p20轉(zhuǎn)染入COS-7細胞中。 3、通過Westernblotting檢測各突變體的表達，采用Quantityone分析各種突變體未酶切和酶切部分的表達強度，并分析未酶切部分所占比例。 結(jié)果： 1、使用PCR定點突變的方法，獲得突變體，經(jīng)序列測定后利用clustalx1.83軟件與模板p20比對，證實突變完全成功。并通過質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、裂解細胞后將細

3、胞裂解物進行Westernblotting免疫印跡實驗，證實在55kDa處存在未酶切的部分，在30kDa處存在可被抗V5抗體檢測的N端部分，經(jīng)過Quantityone分析后發(fā)現(xiàn)，S2/A完全抑制了酶切的發(fā)生，G/A抑制了絕大部分的酶切(未酶切部分占79％)，L/A、I/A、V1/A、V2/A均對酶切產(chǎn)生了不同程度的抑制，未酶切部分分別為22％、39％、14％和17％，而：K/A和S1/A幾乎對酶切沒有影響，其未酶切部分分別為6％和3％，

4、酶切效率與p20(未酶切部分占4％)幾乎一樣。 結(jié)論：以p20為模板的各種突變體突變成功，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導(dǎo)入COS-7細胞并獲得了相應(yīng)突變體的高效表達。通過Westernblotting免疫印跡實驗結(jié)果揭示了酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸對其蛋白酶切的發(fā)生是很重要的，其機理可能是因為此保守基序位于β2和β3片層之間的環(huán)狀區(qū)，其上的氨基酸對于維持粘蛋白的構(gòu)象是必須的。在S1上可能有O型糖鏈的存在，并且去