1、氧氣是生化反應(yīng)的底物,是生物體能量代謝不可缺少的底物,機(jī)體中缺氧會(huì)導(dǎo)致自由基的不正常積累,對(duì)DNA和蛋白產(chǎn)生損害,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生巨大的生存壓力。缺氧會(huì)迫使細(xì)胞通過(guò)能量代謝、生物合成、和氧化還原等一系列改變來(lái)適應(yīng)氧氣濃度的改變;缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,能量消耗減少:缺氧會(huì)刺激細(xì)胞生存因子和血管生成因子的分泌。盡管這些改變是由多種信號(hào)通路共同調(diào)控的,缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduciblefactosr,HIFs)在其中扮演著重要作用。研

2、究發(fā)現(xiàn)HIFs的下游基因功能涉及到葡萄糖的代謝(GLUT1,LDH),凋亡相關(guān)分子(BNIP3),pH值調(diào)節(jié)(CA9),血管生成(VEGFA,PDGF)等過(guò)程。大量的臨床數(shù)據(jù)表明HIFs在許多腫瘤中高表達(dá),其表達(dá)通常與病人的預(yù)后較差,生存期短相關(guān);試驗(yàn)室數(shù)據(jù)也表明HIFs丟失會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減慢,血管生成減少,轉(zhuǎn)移能力降低,而過(guò)表達(dá)HIFs則可以挽救這些現(xiàn)象。
　　HIFs是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異二聚體。哺乳動(dòng)物有三種

3、HIF-α亞基:HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,均可與HIF-β亞單位結(jié)合,其中HIF-1α和HIF-2α的功能研究較多。隨著研究的深入,越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明:HIFs與腫瘤的相關(guān)性是非常復(fù)雜的。首先,HIF-1α亞基的功能在不同腫瘤類型會(huì)有所不同:在腦癌、乳腺癌和卵巢癌中HIF-1α過(guò)表達(dá)與病人的預(yù)后差相關(guān),但在非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌中其表達(dá)與病人的預(yù)后較好相關(guān)。其次,HIF-1α和HIF-2α亞基雖然結(jié)構(gòu)相似,但二者的功能并不

4、重疊,甚至相反。研究發(fā)現(xiàn),HIF-2α可與Myc復(fù)合物協(xié)同結(jié)合在目的基因啟動(dòng)子區(qū)的HIF(HRE)和Myc(Ebox)的結(jié)合位點(diǎn),促進(jìn)c-myc的轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α雖然也可以通過(guò)PASB區(qū)域與Myc結(jié)合,但卻抑制其與靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合,從而下調(diào)c-myc激活的基因,上調(diào)c-myc抑制表達(dá)基因的活性。
　　我們組的前期研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在肝癌中廣泛表達(dá),HIF-1α高表達(dá)與病人的高BCLC分期相關(guān),HIF-1α高表達(dá)意味著血管

5、侵犯,是肝癌術(shù)后總體生存率和復(fù)發(fā)率的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。目前,關(guān)于HIF-2α在肝癌的功能研究較少,本研究旨在通過(guò)臨床標(biāo)本的回顧性分析探索HIF-2α在肝癌的功能,通過(guò)ChIPonchip等試驗(yàn)手段篩選尋找HIF-2α下游效應(yīng)分子,揭示分子機(jī)制,為HIF-2α在肝癌的臨床應(yīng)用提供證據(jù)。
　　第一部分HIF-2α在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義研究
　　本研究旨在分析HIF-2α在肝癌標(biāo)本的表達(dá)情況,探索HIF-2α表達(dá)與肝癌發(fā)展的臨

6、床關(guān)系。通過(guò)對(duì)254例接受手術(shù)治療和157例術(shù)前接受TACE治療的肝癌臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,根據(jù)染色的強(qiáng)度和密度將病人分成高表達(dá)和低表達(dá)組;分析病人的臨床病理相關(guān)指標(biāo),研究HIF-2α表達(dá)水平與病人年齡、性別、肝炎病毒標(biāo)志物、肝硬化、腫瘤大小、分化、包膜、TNM分期等臨床病理特征及患者的生存時(shí)間,生存率等的關(guān)系,擬在發(fā)現(xiàn)HIF-2α與肝癌病人的預(yù)后、總體生存時(shí)間、生存率等之間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常的肝臟相比,腫瘤中

7、HIF-2α的RNA水平顯著下降(p=0.04),254例接受手術(shù)治療的肝癌病人的免疫組化染色結(jié)果表明HIF-2α在大部分腫瘤中均有表達(dá)。根據(jù)HIF-2α表達(dá)強(qiáng)度,254例病人分成低表達(dá)組(＜50％)及高表達(dá)組(＞50％)。高表達(dá)組的五年總體生存率是61.5％:低表達(dá)組的是46.6％,高表達(dá)組顯著高于低表達(dá)組(p=0.023)。高表達(dá)組的平均生存時(shí)間是42.62個(gè)月,而低表達(dá)組的平均生存時(shí)間是36.33個(gè)月,二者差異顯著(p=0.028

8、)。單因素生存分析顯示AFP(p=0.007),GGT(p=0.004),腫瘤直徑(p＜0.001),腫瘤數(shù)目(p=0.003),包膜完整性(p=0.011),TNM分期(p=0.018)及。HIF-2α(p=0.023)均為影響病人5年總體生存的因素,其中AFP(p=0.045),腫瘤數(shù)目(p=0.009),TNM分期(p=0.050)也是影響病人無(wú)瘤生存的因素。高表達(dá)HIF-2α組的五年腫瘤復(fù)發(fā)率是60.7％;低表達(dá)組的五年腫瘤復(fù)發(fā)

9、率是63.4％,兩組的無(wú)瘤生存率無(wú)顯著差異(p=0.929);高表達(dá)組的平均無(wú)瘤生存時(shí)間是32.80個(gè)月,而低表達(dá)組的為30.00個(gè)月,二者差異不顯著(p=0.355)。為進(jìn)一步分析HIF-2α在病人亞群中的預(yù)測(cè)作用,我們將254例病人按照年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、TNM等病理臨床指標(biāo)進(jìn)行分層,發(fā)現(xiàn)HIF-2α的預(yù)測(cè)作用主要存在于單腫瘤,腫瘤包膜完整,EdmonsonⅠ-Ⅱ期,年紀(jì)大于50歲病人中。在單腫瘤病人中HIF-

10、2α高表達(dá)的病人的生存率為67％,而低表達(dá)病人的生存率為48.7％(p=0.011);在腫瘤包膜完整的病人中,HIF-2α高表達(dá)的病人的生存率為71.6％,而低表達(dá)病人的生存率為60.3％(p=0.005);在EdmonsonⅠ-Ⅱ期的病人中,HIF-2α高表達(dá)的病人的生存率為66.7％,而低表達(dá)病人的生存率為50.9％(p=0.027);在TNMⅠ期病人中HIF-2α高表達(dá)的病人的生存率為65.5％,而低表達(dá)病人的生存率為50.0％(

11、p=0.04):在年紀(jì)大于50歲的病人中,HIF-2α高表達(dá)的病人的生存率為65.3％,而低表達(dá)病人的生存率為44.7％(p=0.01)。研究結(jié)果表明:HIF-2α在手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本中的表達(dá)情況與病人的總體生存相關(guān),高表達(dá)意味著病人的預(yù)后較好,尤其是年齡大于50歲、腫瘤分期較早、包膜完整的單灶肝癌病人亞群中。
　　免疫組化染色結(jié)果表明HIF-2α在術(shù)前接受TACE治療的肝癌病人中廣泛表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度高于只接受手術(shù)治療的病人。同樣根

12、據(jù)HIF-2α的染色強(qiáng)度對(duì)這部分病人分成高表達(dá)組和低表達(dá)組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HIF-2α組病人的生存率為27.1％,平均生存時(shí)間為37.15個(gè)月;低表達(dá)組病人的生存率為20.4％,平均生存時(shí)間為29個(gè)月,高表達(dá)HIF-2α組病人的術(shù)后總體生存要顯著高于低表達(dá)組病人(p=0.034)。術(shù)后復(fù)發(fā)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率為78％,低表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率為81.6％,二者之間無(wú)顯著差異(p=0.379),高表達(dá)組的平均復(fù)發(fā)時(shí)間為術(shù)后25.9

13、3個(gè)月,低表達(dá)組的復(fù)發(fā)時(shí)間為19.20個(gè)月,二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果表明:HIF-2α在手術(shù)切除前接受TACE治療的肝癌標(biāo)本中的表達(dá)情況與病人的總體生存相關(guān),高表達(dá)意味著病人的預(yù)后較好。
　　HIF-2α與臨床病例特征之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)表明在254例標(biāo)本中HIF-2α與AFP(p=0.025)、腫瘤直徑(p=0.001)相關(guān)性顯著。單因素分析表明HIF-2α、AFP、和腫瘤直徑是影響病人術(shù)后總體生存時(shí)間的重要指標(biāo),多因素分析表明腫

14、瘤直徑是預(yù)測(cè)病人術(shù)后總體生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。對(duì)術(shù)前接受TACE治療的病人多因素分析結(jié)果表明HIF-2α可以作為總體生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。這些數(shù)據(jù)提示HIF-2α可能通過(guò)影響腫瘤的生長(zhǎng)而進(jìn)一步影響病人的預(yù)后。
　　第二部分HIF-2α促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌的生長(zhǎng)
　　本部分旨在通過(guò)研究HIF-2α對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,分析HIF-2α影響腫瘤生長(zhǎng)的原因。利用lipofection2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,構(gòu)建高表達(dá)及knockd

15、ownHIF-2α的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,利用CCK8法檢測(cè)HIF-2α對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,利用免疫染色染色檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡比例的改變,應(yīng)用AnnexinV和PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡等分析HIF-2α水平對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、及凋亡的影響。利用免疫缺陷的裸鼠模型研究HIF-2α水平對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常的轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)HIF-2α可以顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)(p＜0.001),而下調(diào)HIF-2α水平對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著抑

16、制。對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡分析發(fā)現(xiàn):在MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞中,Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例均沒(méi)有隨著HIF-2α的水平而有明顯變化,但HIF-2α高表達(dá)顯著提高了活化的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞比例;AnnexinV和PI染色,流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIF-2α高表達(dá)組的細(xì)胞凋亡比例高達(dá)26％。Realtime:PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因,如Caspase7,Caspase8,BID的水平顯著上調(diào)。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)顯示:過(guò)表達(dá)HIF-2α組的腫瘤明顯小

17、于對(duì)照空載體組的腫瘤,約為其重量的1/10,差異顯著(p＜0.001),knockdownHIF-2α組的腫瘤重量稍小于空載體組腫瘤,差異不顯著;對(duì)腫瘤的免疫組化染色結(jié)果顯示:HIF-2α高表達(dá)組的Activated-Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯增高。
　　研究表明:HIF-2α與肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)關(guān)系密切,對(duì)肝癌細(xì)胞增殖沒(méi)有影響,但可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　第三部分HIF-2α

18、抑制TFDP3基因的表達(dá),促進(jìn)E2F1信號(hào)通路,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡
　　本部分旨在應(yīng)用ChIPonchip技術(shù)檢測(cè)篩選HIF-2α在肝癌細(xì)胞系MHCC97H中調(diào)控的下游靶基因,探索HIF-2α促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)理。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將所得到的基因進(jìn)行功能和信號(hào)歸類,挑選其中影響細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等的基因,并在MHCC97L,與MHCC97H同源的另一個(gè)肝癌細(xì)胞系中,利用ChIPPCR驗(yàn)證ChIPonchip結(jié)

19、果;利用實(shí)時(shí)定量PCR在過(guò)表達(dá)HIF-2α的MHCC97H細(xì)胞系和對(duì)應(yīng)的空載體細(xì)胞中檢測(cè)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平變化;挑選變化較大的基因,通過(guò)上調(diào)或下調(diào)該靶基因的水平,分析其在HIF-2α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過(guò)ChIPonchip,我們篩選到330個(gè)HIF-2α的靶基因;通過(guò)功能分析及信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及到ErbB、p53、MAPK、TGF-β、Wnt、和Hedgehog信號(hào)通路;根據(jù)對(duì)基因富

20、集的峰值得分和峰值誤差排序,結(jié)合基因的功能及信號(hào)通路歸類,我們挑選了了部分基因(GZF1、RUNX1、RADIL、TFDP3、MMP16、FNDC1、GSPT1)在MHCC97L細(xì)胞中對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。Chip-PCR結(jié)果表明:與對(duì)照IgG相比,大部分基因在HIF-2α組中高富集,與ChIPonChIP的一致。RealtimePCR結(jié)果顯示在高表達(dá)HIF-2α的:MHCC97H細(xì)胞中FNDC1、TFDP3基因的表達(dá)水平顯著下降,其中TFDP

21、3基因的下降幅度高達(dá)10倍。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-2α導(dǎo)致TP73和ARF基因的RNA水平上調(diào)2倍以上,14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID的上調(diào)倍數(shù)也在2倍以上,TP53、TP53INP2、P21、CyelinD1和BAK1的RNA水平有少量變化。當(dāng)細(xì)胞中TFDP3和HIF-2α兩基因的表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)時(shí),ARF、14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)入空載體的相當(dāng);與單獨(dú)高表達(dá)HIF

22、-2α組的相比,ARF、14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID基因的表達(dá)水平顯著下降;TP53、TP53INP2、P21、CyclinD1和BAK1基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)。在過(guò)表達(dá)HIF-2α的MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)TFDP3基因,通過(guò)免疫染色我們發(fā)現(xiàn)Activated-caspase3細(xì)胞陽(yáng)性比例顯著下降,流式檢測(cè)結(jié)果顯示早期凋亡細(xì)胞的比例從20％降到12％。
　　研究結(jié)果表明:TF

23、DP3是HIF-2α的下游靶基因之一,其表達(dá)水平受到HIF-2α的抑制;細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-2α可以提高E2F1通路的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)HIF-2α和TFDP3可以部分抑制E2F1信號(hào)通路,減少HIF-2α過(guò)表達(dá)引發(fā)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果顯示HIF-2α通過(guò)抑制TFDP3基因的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)E2F1信號(hào)通路活性,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論
　　1.在本研究中,我們回顧性研究分析了254例接受手術(shù)治療的肝

24、癌標(biāo)本,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中AFP水平較高、腫瘤直徑較大的病人的HIF-2α表達(dá)水平較低。腫瘤標(biāo)本的HIF-2α表達(dá)水平低的病人與表達(dá)高的病人相比,其總體生存時(shí)間較短,生存率低。在肝癌中高表達(dá)HIF-2α的病人,預(yù)后較好。
　　2.HIF-2α在術(shù)前接受TACE治療的肝癌病人中的預(yù)測(cè)作用與只接受手術(shù)治療的病人相同。肝癌中HIF-2α低表達(dá)的病人的生存時(shí)間和生存率顯著低于高表達(dá)的病人。單因素分析結(jié)果表明腫瘤中低表達(dá)HIF-2α與病人的總體

25、生存率低相關(guān),多因素分析結(jié)果表明腫瘤中HIF-2α的表達(dá)水平是病人總體生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。
　　3.體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)HIF-2α的MHCC97H細(xì)胞在裸鼠中產(chǎn)生的腫瘤顯著小于轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明過(guò)表達(dá)HIF-2α顯著降低肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。這些數(shù)據(jù)與我們的臨床數(shù)據(jù)是一致的,均表明HIF-2α與腫瘤的生長(zhǎng)關(guān)系密切,高表達(dá)HIF-2α的腫瘤直徑較小。
　　4.增殖和凋亡的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明HI

26、F-2α可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,對(duì)細(xì)胞的增殖影響不明顯。
　　5.通過(guò)ChIPonchip技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)在MHCC97H細(xì)胞中存在330個(gè)HIF-2α的潛在下游靶基因。TFDP3是HIF-2α的下游靶基因之一,其轉(zhuǎn)錄水平受到HIF-2α的抑制,通過(guò)外源性轉(zhuǎn)入恢復(fù)TFDP3基因的表達(dá)水平可以顯著降低HIF-2α引發(fā)的細(xì)胞凋亡,E2F1信號(hào)通路中的相關(guān)凋亡基因水平顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明TFDP3在HIF-2α引發(fā)的凋亡中起著重要的作用

27、。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.我們首次發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HIF-2α表達(dá)水平較正常組織的降低,肝癌組織中HIF-2α低表達(dá)的病人的總體生存時(shí)間和生存率明顯低于高表達(dá)病人,肝癌組織中的HIF-2α表達(dá)水平與病人的總體生存相關(guān)。
　　2.我們首次發(fā)現(xiàn)TFDP3是HIF-2α的下游靶基因。
　　3.我們首次發(fā)現(xiàn)HIF-2α通過(guò)抑制TFDP3基因的表達(dá)促進(jìn)E2F1信號(hào)通路引發(fā)的凋亡。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　1.我們結(jié)果