1、隨著生活水平的提高，生活方式西方化及人口老齡化，人類健康面臨的慢性疾病威脅正日益加重，其中糖尿病及其慢性并發(fā)癥更是危害健康的無情殺手。已證實長期高血糖通過多種方式引起骨代謝紊亂，如糖毒性、高滲性及晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)等。體外實驗也表明，高濃度葡萄糖對成骨細胞的增殖、分化和礦化產(chǎn)生明顯的抑制作用。骨保護素(OPG)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)及核因子-κB受體活化因子(RANK)是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)控破骨細胞分化激活的

2、細胞因子，其在骨代謝中起重要作用。在骨組織中，成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結(jié)合后，促進破骨細胞的分化和激活，并抑制破骨細胞的凋亡。由成骨細胞分泌的OPG可與RANKL結(jié)合，競爭性抑制RANKL與RANK的結(jié)合，減少破骨細胞生成，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。
　　二甲雙胍（metformin,MET）作為治療糖尿病的一線藥物，其通過激活AMP激活蛋白激酶（activated prote

3、in kinase, AMPK）信號系統(tǒng)發(fā)揮降糖作用。新的研究表明二甲雙胍能夠降低1型及2型糖尿病患者骨折的發(fā)生率，對骨骼產(chǎn)生有益影響，其具體機制可能為二甲雙胍激活AMPK信號通路繼而引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide sythase, eNOS)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達增加，影響成骨細胞的增殖、分化和礦化過程，對骨代謝發(fā)揮一定保

4、護作用。本實驗中我們觀察高糖環(huán)境對成骨細胞增殖、分化及礦化標志物、相關基因表達的影響，以及二甲雙胍干預后相應基因表達的變化，進一步探討在高糖環(huán)境中二甲雙胍對成骨細胞代謝的保護作用。
　　一、葡萄糖對成骨細胞MG63增殖及相關基因表達的影響
　　目的：探討不同濃度葡萄糖對成骨細胞MG63增殖的影響及細胞相關基因表達的變化。
　　方法：(1)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3、5.5/16.7、5.5/33.3m

5、mol/L)干預細胞MG63為干預組，設磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對照組，應用細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖；(2)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干預細胞MG63為干預組，同時設磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對照組，應用生化分析儀檢測細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)的含量；(3)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干預細胞MG63為干預組，同時設磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對

6、照組，應用RT-PCR檢測Ⅰ型膠原(COLⅠ)、骨鈣素(OCN)、骨保護素(OPG)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)基因的表達。
　　結(jié)果：(1)收集葡萄糖作用3天后的MG63細胞株，CCK-8法檢測結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組抑制細胞增殖(P<0.05)，且5.5/16.7mmol/L、5.5/33.3mmol/L葡萄糖交替培養(yǎng)組抑制作用更明顯(P<0.01)，而5.5mmol/L葡萄糖濃度組無顯

7、著變化；(2)不同濃度葡萄糖分別干預MG63細胞6、12、18天后，檢測細胞內(nèi)ALP的活性，結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組細胞表達ALP均降低(P<0.05)，尤其在第6、12天時，33.3mmol/L組變化較顯著(P<0.01)；(3) RT-PCR結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組OPG、OCN表達下調(diào)(P<0.05)，尤其在33.3mmol/L濃度時更顯著(P<0.01)；而RANKL在33.3mm

8、ol/L時表達上調(diào)(P<0.05)，COLⅠ無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：高糖及波動性高糖明顯抑制成骨細胞增殖，高糖環(huán)境可下調(diào)成骨細胞內(nèi)ALP活性、OCN基因的表達，表明高糖可減少成骨細胞數(shù)量，同時減緩成骨細胞基質(zhì)成熟、礦化，從多個階段減弱成骨細胞的成骨能力。進一步的實驗結(jié)果顯示，高糖下調(diào)OPG的表達、上調(diào)RANKL的表達，使OPG/RANKL比值下降，從而激活破骨細胞，促進破骨細胞的分化、成熟，加快骨吸收，可能是糖尿病

9、性骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機制之一。
　　二、二甲雙胍對高糖介導的成骨細胞MG63增殖及相關基因表達的影響
　　目的：觀察二甲雙胍對高糖介導下成骨細胞MG63增殖及相關基因表達的影響，探討高糖環(huán)境中二甲雙胍對骨代謝的保護作用。
　　方法：(1)實驗分組均以不同濃度二甲雙胍(0、200、300、400mmol/L)干預高糖(16.7mmol/L)環(huán)境中MG63；（2）應用CCK-8檢測成骨細胞增殖；(3)應用生化分析儀檢測成骨

10、細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)的含量；(4)應用 RT-PCR法檢測細胞Ⅰ型膠原(CoLⅠ)、骨鈣素(OCN)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達；
　　結(jié)果：(1) CCK-8結(jié)果顯示：各濃度組細胞生長較高糖對照組均顯著增加(P<0.01)，提示二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對成骨細胞增殖的抑制；(2) SFBC速率法檢測顯示：ALP活性較對照組有所增加(P<0.05)，尤其是第6天及第12天200、300mmol/L二甲雙胍組ALP活性增加

11、較顯著(P<0.01)，表明二甲雙胍可能增加成骨細胞骨形成周期中ALP活性；(3) RT-PCR實驗結(jié)果顯示：二甲雙胍干預后COLⅠ、OCN表達上調(diào)(P<0.05)，其中COLⅠ在400mmol/L二甲雙胍、OCN在300mmol/L二甲雙胍組時表達最高(P<0.01)；MMP-1、MMP-2、MMP-3表達較對照組均有下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，MMP-8表達在400mmol/L MET組表達下調(diào)(P<0.05)。