1、馬動脈炎病毒(equine arthritis virus，EAV)屬于動脈炎病毒科，為單股正鏈RNA病毒，可以引起馬的病毒性動脈炎。EAV基因組共編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白和至少13個非結(jié)構(gòu)蛋白。其中非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4是一種典型的3C樣絲氨酸蛋白酶，具有切割活性。根據(jù)報道，nsp4的三維結(jié)構(gòu)有已知最小的胰凝乳蛋白酶樣折疊，還有一個典型的三聯(lián)體催化中心（Ser-120，His-39和Asp-65）。
　?、裥透蓴_素是宿主細胞在病毒感染時產(chǎn)生

2、的最主要的抗病毒細胞因子，之前的研究發(fā)現(xiàn)EAV可以抑制IFN-β的產(chǎn)生，但具體的作用機制尚不清楚。有文獻報道，甲肝病毒和口蹄疫病毒的3C蛋白酶都可以通過其切割活性來抑制IFN-β的產(chǎn)生，那么EAV的3C樣蛋白酶即nsp4是否也可以抑制IFN-β的產(chǎn)生呢？
　　鑒于此，本論文以EAV nsp4為研究對象，初步探討了其對IFN-β產(chǎn)生的影響，并進一步解釋了其作用機制，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.超表達EAV nsp4抑制IFN-

3、β的產(chǎn)生及干擾素刺激基因的表達
　　將構(gòu)建的EAV nsp4的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-T細胞，分別用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Real-time PCR檢測超表達nsp4對SeV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明EAV nsp4在啟動子水平和mRNA水平均能夠顯著抑制IFN-β的產(chǎn)生。我們的研究還發(fā)現(xiàn)EAV nsp4可以顯著抑制ISG15、ISG20、ISG54和ISG56等多種ISGs的表達。
　　2.EAV nsp4通

4、過抑制NF-κB和IRF3信號通路進而抑制IFN-β的產(chǎn)生
　　干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是調(diào)節(jié)IFN-β產(chǎn)生的兩個重要轉(zhuǎn)錄因子，為了闡明EAV nsp4是通過哪個轉(zhuǎn)錄因子來抑制IFN-β的產(chǎn)生的，我們利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western Blot實驗檢測超表達EAV nsp4對這兩個轉(zhuǎn)錄因子的影響。雙熒光素酶檢測結(jié)果表明，nsp4可以在啟動子水平顯著抑制IRF3和NF-κB的活化，并且呈現(xiàn)一定

5、的劑量依賴性;Western Blot結(jié)果表明nsp4可以抑制IRF3以及p65的磷酸化。這就說明EAV nsp4是通過抑制IRF3和NF-κB兩個轉(zhuǎn)錄因子的活性進而抑制IFN-β的產(chǎn)生。
　　3.EAV nsp4對IFN-β的抑制依賴其3C樣絲氨酸蛋白酶活性
　　EAV nsp4是一種典型的3C樣絲氨酸蛋白酶。為了探究nsp4對IFN-β的抑制是否與其3C樣蛋白酶酶活性是否有關(guān)，我們構(gòu)建了EAV nsp4的3個酶活性位點突

6、變體，即nsp4-H39A，nsp4-D65A和nsp4-S120A。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，與野生型的EAV nsp4相比，nsp4的酶活性位點突變體對IFN-β的抑制作用明顯減弱，這就表明EAV nsp4對IFN-β的抑制依賴其3C樣絲氨酸蛋白酶活性。
　　4.EAV nsp4通過切割NEMO抑制IFN-β的產(chǎn)生
　　RIG-Ⅰ/MDA5信號通路是RNA病毒感染時宿主產(chǎn)生干擾素的一條重要信號通路。為了探究nsp4

7、抑制IFN-β產(chǎn)生的作用靶標，我們將RIG-Ⅰ、MDA5、IPS1和TBK1分別與nsp4共轉(zhuǎn)染HEK293-T細胞，雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)EAV nsp4的作用靶標在TBK1的上游，進一步我們又將RIG-Ⅰ、MDA5、IPS1和NEMO分別與nsp4共轉(zhuǎn)染，Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)nsp4可以切割NEMO，而且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。這就表明EAV nsp4是通過切割NEMO來抑制IFN-β的產(chǎn)生。
　　5.EAV nsp4